腺病毒介导的人骨形成蛋白2基因治疗的免疫学研究

目的评价机体对腺病毒介导的人骨形成蛋白2(adenovirusmediatedhumanbonemorphogeneticprotein2,Ad-hBMP-2)基因治疗的免疫学反应。方法崇明山羊12只,手术截去右侧胫骨中段2.1cm,制备胫骨干缺损模型,随机分为2组。将Ad-hBMP-2转染的山羊骨髓间充质干细胞(marrowmesenchymalstemcells,MSCs,转染组,n=7)及未转染的MSCs(未转染组,n=5)分别植入骨缺损内。于术后4、8、16及24周摄X线片检查骨缺损愈合情况,并对治疗前后机体对腺病毒的细胞和体液免疫反应进行检测。结果X线片示,转染组4～8周,骨缺损内有连续性骨痂形成;24周,有6侧骨缺损完全愈合,部分骨髓腔再通。未转染组4～8周,骨缺损内骨痂形成较少,与骨端界限清楚;24周,仅2侧骨缺损愈合。淋巴细胞与MSCs混合培养示淋巴细胞刺激指数(stimulationindex,SI)于植入后14d升高,转染组4.213±1.278,未转染组-0.310±0.147,且差异有统计学意义(P<0.05);28d后下降,转染组2.544±0.957,未转染组3.104±0.644,差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后14、28、49和120d,转染组的血浆腺病毒中和抗体滴度分别为2.359±0.226、2.297±0.200、2.214±0.215和2.297±0.210,未转染组分别为-0.175±0.335、-0.419±0.171、0±0.171和0.874±0.524,两组各时间点差异均有统计学意义(P<0.05)。结论腺病毒介导的基因治疗可引起机体对腺病毒的细胞及体液免疫反应,从而逐渐消除腺病毒基因和相关蛋白的影响。

一个革命性的抗癌研究策略:癌症的靶向基因-病毒治疗

2001年,笔者提出了癌症的靶向基因-病毒治疗(cancer targeting gene-viro-therapy,CTGVT)的概念,即将一个抗癌基因插入到溶瘤病毒(oncolytic virus,OV)中,从而将基因治疗与溶瘤病毒各自的优势结合起来,由于溶瘤病毒能大量复制,插入其中的基因也能大量复制,故其抗肿瘤效果大增,较单用基因治疗或OV治疗强数十至上百倍。随后又引入双基因策略(CTGVT-DG),即向OV载体插入两个抗癌基因,由于两个抗癌基因之间可能存在互补或协同效应,在一些动物癌症模型中几乎能杀灭全部移植性肿瘤。近年来又采用纳米粒子把CTGVT-DG病毒颗粒包被,或者采用溶瘤痘病毒(OncoPox)作为载体与CTGVT-DG策略相结合,后者将可构建一系列抗癌作用极好的双基因OncoPox-gene1-gene2产物。国外多数使用OV-GM-CSF策略,仅局限于GM-CSF的免疫功能,忽视了基因复制的剂量效应及其重要性,这就是中国的CTGVT-DG胜过西方的优势之处。

Q-PCR法检测腺病毒基因治疗产品中的复制型腺病毒

目的:建立Q-PCR法检测腺病毒基因治疗产品中的复制型腺病毒(RCA)。方法:首先制备高纯度的pXC1质粒参考品(含有E1基因序列),紫外吸收法定量后经过数学换算得到拷贝数;然后比较染料法和探针法的灵敏度,建立适用的Q-PCR检测方法;最后用新建Q-PCR法定量测定腺病毒基因治疗产品中的RCA。结果:pXC1质粒参考品的拷贝数初步标定为2.6×1010拷贝/μL;探针法的灵敏度比染料法高1000倍;将pXC1质粒参考品应用于Q-PCR(探针法)测定腺病毒基因治疗产品中的RCA,标准曲线回归方程为y=-1.416ln(x)+47.395,R^2=0.9966,供试品的Cq值均位于标准曲线范围内。结论:新建Q-PCR法适用于检测腺病毒基因治疗产品中的RCA,且结果准确可靠。

抗病毒基因治疗的新技术

以转基因置换和靶基因表达为特征的基因疗法,在某些遗传疾病和恶性肿瘤的治疗中已显示良好的前景。近年来,病毒基因治疗的研究也取得了很大的进展,除了反义基因治疗、基因疫苗、显性失活突变体、单链抗体外,还出现了如RNA干扰等新的基因技术。本文就病毒性疾病基因治疗的策略及研究现状进行综述。

以聚乙烯亚胺及其衍生物为骨架在非病毒基因治疗中的研究

攻克肿瘤最有潜力的方法是基因治疗,目前研究最多的是以聚乙烯亚胺(PEI)及其衍生物为病毒载体的非病毒基因疗法。虽然聚乙烯亚胺越来越多地应用于非病毒基因递送系统,但它仍存在不足之处,需作出进一步的研究和改进,主要可从以下方面来进行改进:筛选合适的PEI,连接屏蔽基团,连接靶向配体,引入核定位信号和拟病毒颗粒模式等。本文主要介绍一些新的研究策略及改进措施。

抗病毒基因治疗

基因治疗是将治疗性基因导入到发生病变的细胞内,以替补突变基因的功能,或封闭异常基因表达的治疗方法。抗病毒基因治疗可以概括为两个方面:细胞内免疫和基因免疫技术。

非病毒基因治疗的研究进展

非病毒基因治疗是相对于病毒性基因治疗而言 ,指采用非病毒的载体进行的基因治疗。非病毒的基因载体比病毒性基因载体具有高安全性、低免疫原性及易于生产的特点。本文就非病毒基因治疗所采用的主要方法、面临的主要问题及发展方向作一概括的介绍。随着人类对疾病发病分子机制的深入研究及人类基因组计划的实施 ,非病毒基因治疗将在人类疾病的治疗中发挥重要作用。

非病毒基因治疗在口腔颌骨缺损中的应用

利用GBR技术修复口腔内骨缺损是目前临床常用的方法,但骨移植材料单独应用时其诱导成骨性能尚不能满足所有临床要求。基因治疗是将基因传送至缺损位点促进骨生成的一种组织工程学治疗技术,按传送方式不同分为病毒载体和非病毒载体基因治疗,其中非病毒载体基因治疗利用非病毒载体复合物转染目标细胞促进其表达成骨蛋白。本文就非病毒载体基因治疗载体的选择,载体复合物的转染,传送工具以及向临床转换情况等做一综述。

基因工程腺病毒H101逆转A549/DDP细胞对顺铂耐药性的实验研究

背景及目的:耐药性产生是化疗失败的主要原因之一,克服耐药性的方法之一是使用逆转剂。目前尚无一种理想的、可应用于临床的顺铂(DDP)耐药逆转剂。本研究探讨基因工程腺病毒H101对DDP耐药性的逆转作用及其机制。方法:体外利用人肺腺癌细胞株A549的DDP耐药模型A549/DDP,采用MTT法检测H101对A549/DDP细胞耐药性的逆转作用。用流式细胞仪(FCM)测定细胞多药耐药蛋白1(multidrugresistantprotein1,MRP1)、谷胱甘肽鄄S鄄转移酶(GST)及TOPO鄄Ⅱ蛋白表达量,荧光鄄考马斯亮蓝法检测细胞内GSH含量,原子吸收法测定细胞内铂浓度。结果:A549/DDP细胞对DDP的耐药指数为14.3。加入H101后,DDP对A549/DDP的半数抑制浓度(IC50)由352.4μmol/L降至61.6μmol/L,逆转倍数为5.7倍。FCM检测结果显示,A549/DDP细胞的GST和TOPO鄄Ⅱ蛋白水平均较A549细胞高,而两种细胞内均未检测到MRP1的表达,经H101处理后的A549/DDP细胞胞内GST蛋白和TOPO鄄Ⅱ蛋白水平均明显下降。A549/DDP胞内GSH含量比A549高2倍多;H101感染A549/DDP细胞后,胞内的GSH含量下降,随着H101剂量的增加,胞内GSH含量逐渐下降,达A549细胞内GSH水平。原子吸收法测定细胞内铂含量的结果显示,A549细胞内铂含量是A549/DDP细胞内铂含量的3倍,加入H101后,A549细胞内铂的含量无明显变化,但A549/DDP细胞内铂的含量明显增加。结论:H101能逆转A549/DDP对DDP的耐药性,H101逆转DDP耐药性的机制可能是减少A549/DDP细胞内GSH和TOPOⅡ蛋白的水平,增加了A549/DDP细胞内铂的蓄积。

溶瘤腺病毒靶向治疗恶性肿瘤研究进展

恶性肿瘤是当今世界严重威胁人类健康的疾病,也是人类生命的主要"杀手"之一。传统的放、化疗及手术治疗存在抗肿瘤能力低、杀伤指数过小、副作用大极易复发等缺点,对很多中晚期肿瘤患者往往缺少合适的治疗手段,因此,开发安全高效的生物治疗方法已成为肿瘤治疗领域关注的热点。基因-病毒治疗即是其中之一,它是将基因通过载体转入患者体内,从而达到治疗和预防肿瘤的目的。溶瘤腺病毒作为基因治疗的一种常用载体,在肿瘤治疗方面有着自生的优点和长处。本文简单对这一领域的研究进展进行综述。

基于EBNA1和oriP的载体在基因治疗中的应用研究进展

非病毒载体用于基因治疗的主要问题是导入靶细胞的效率较低,目的基因表达水平低,疗效持续时间也较短。EBNA1和oriP元件使引入该元件的质粒在真核细胞内保持为游离体、转运入核、转录增强。质粒携带的目的基因能够获得较高的转染效率,高水平、持续的表达。基于EBNA1 oriP的质粒在肿瘤、单基因缺陷先天性疾病、TNF相关的炎性疾病的基因治疗中显示了良好的应用前景。EBNA1 oriP元件用于构建人工染色体,携带目的基因的调控序列,可望实现可调控的基因治疗。

乙型肝炎病毒表面抗原基因的克隆及序列分析

目的克隆并鉴定乙型肝炎病毒表面抗原基因,为下一步构建该重组腺病毒载体以及进一步研究腺病毒载体的包装及在乙型肝炎病毒基因治疗中的作用。方法参照人 HBV adr 亚型序列,设计和合成 S 基因特异引物。应用 PCR 技术,从含有 HBsAg 的 HBV DNA 中扩增目的 DNA,通过 TA 连接将其克隆人 pGEM-T easy 载体,经限制性内切酶 BglⅡ/SalⅠ鉴定后,进一步测序鉴定。结果从乙肝表面抗原阳性(HBsAg+)血清中成功提取 HBV DNA,并以此 DNA 为模板,成功扩增出 S 基因,测序结果与 GenBank 中注册的相应序列比对,核苷酸序列的同源性高达92％～99％,预测氨基酸序列同源性亦达82％。结论从 HBsAg 阳性血清中成功克隆出 S 基因序列,为进一步构建重组腺病毒及后续实验奠定了基础。

携带11R穿膜肽-p53融合蛋白基因的溶瘤腺病毒的抗肿瘤作用

p53是研究较为广泛的抑癌基因,可通过不同的途径来抑制或杀伤肿瘤细胞。为增强p53的抗瘤活性,将穿膜肽11R与p53的融合蛋白基因插入增殖型腺病毒载体中,在293细胞中经同源重组筛选获得重组溶瘤病毒SG7605-11R-p53;利用Western blot检测11R-p53的表达情况,TCID50方法测定病毒滴度;应用细胞活力检测实验(MTT)比较病毒杀伤肿瘤及正常细胞的效果。结果显示:SG7605-11R-p53所携带的11R-p53基因在所选细胞株中都能正确表达,与SG7605-p53、AD5-p53相比具有更好的杀伤肿瘤细胞的效果,显示了较强的抗肿瘤效应。说明SG7605-11R-p53是一种有潜力的治疗肿瘤的新型基因-病毒治疗系统。

微环载体与基因治疗

基因治疗是将有治疗作用或正常基因的DNA序列导入靶细胞,通过纠正基因缺陷或发挥治疗作用而达到治疗疾病的目的。基因治疗的关键技术之一是研发用于真核细胞转移基因的安全有效的载体系统。病毒和非病毒载体系统均有各自的优势和缺点。微环载体是一种来源于质粒DNA的新型的较小的超螺旋表达元件,通过在大肠杆菌体内发生位点特异性结合而产生,并已应用于基因治疗。由于微环载体缺乏原核DNA骨架序列,如抗生素基因、原核复制起始点等,可提高治疗基因表达水平、基因治疗的安全性及降低炎症反应。本文就微环载体的产生、提高转基因表达的机制及在基因治疗中的应用作一综述。