以PCR为基础的基因破坏技术在酿酒酵母中的应用

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一种已知全序列的重要模式生物,具备单双倍体特性、乙醇耐受性强、高效体内重组的能力、可操作性强等优点。同时酿酒酵母是第一个完成基因组测序的真核生物,各种遗传操作技术业已成熟,因此它在基因操作和生物能源方面是首选的研究对象。以PCR为基础的基因破坏方法第一次在酿酒酵母中被报道后,其方法和技术得到了迅速的改进和发展,目前在酵母中已经广泛应用。文章主要介绍这种方法在酿酒酵母中应用的基本原理和研究方法,以及与其他传统基因破坏方法相比较的优缺点、存在的问题等。说明以PCR为基础的基因破坏方法能够避免繁琐的基因克隆操作,省时、省力、方便。

基于CRISPR/Cas9方法构建‘沪农灵芝1号’基因编辑系统

构建密码子优化的cas 9表达质粒pMD-EXP-cas 9,通过聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)介导转化灵芝(Ganoderma lucidum)菌株‘沪农灵芝1号’(‘Hunong No.1’)单核菌株L1,得到含有cas9完整表达盒的菌株L1-cas9。利用T7启动子构建靶向ura3基因的表达质粒psgRNA-1和psgRNA-2,体外转录后得到sgRNA 1和sgRNA 2。通过PEG介导的转化,将sgRNA 1和sgRNA 2转化进L1-cas9的原生质体中,得到ura3基因被破坏的突变体,首次在‘沪农灵芝1号’菌株单核体中构建成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9)基因编辑系统,ura3基因的编辑效率为4个突变体(107个原生质体)。利用0.006%曲拉通X-100优化PEG介导的转化系统,可使ura3基因编辑效率提高至18个以上突变体(107个原生质体),本研究的结果为灵芝基因功能的研究和分子育种提供更高效的方法。

阿维链霉菌中aveD基因阻断对阿维菌素合成的影响

利用用于基因破坏的重组质粒pCZ2 (pKC1 1 39∷ 475bpaveD)对阿维菌素 (Avermectin)产生菌阿维链霉菌 (Streptomycesavermitilis) 76- 9的aveD基因进行插入失活 ,将获得的aveD破坏子进行摇瓶发酵和阿维菌素初步提取和HPLC检测 ,发现破坏子仅产生四个主要组分 ,但它们的保留时间分别比Bla、Blb、B2a和B2b的略长。进而将粗提液纯化并获得晶体 ,以UV、IR、NMR ( 1H NMR和13C NMR)和MS进行结构分析 ,并结合HPLC检验 ,证明它们属于C5 氧 阿维菌素B。说明阿维链霉菌的aveD基因破坏 ,不仅丧失了合成阿维菌素A组分的能力 ,也造成了其下游的aveF基因不能表达 ,因此只产生了C5 氧 阿维菌素B。

大肠杆菌莽草酸途径限速酶多基因盒的构建及基因替换

优化大肠杆菌芳香族氨基酸生物合成代谢途径 ,构建莽草酸代谢途径限速酶的多基因盒PtacaroAaroCaroBkan .利用Red重组系统 ,在破坏整体调控基因csrA时 ,替换多基因盒 .Southern印迹证实 ,基因破坏和基因替换是成功的 .摇瓶发酵表明 ,构建的基因工程菌株比原始菌株基础产酸率提高了 4 5

aveD基因失活提高阿维菌素工业菌株B组分产量

目的破坏除虫链霉菌ave D基因,提高阿维菌素B1a的发酵单位。方法将ave D基因内部364bp的Sma I-Sma I片段以相反的方向插入到原位置,构建重组质粒p UAm T-D7,并转化到阿维菌素工业生产菌Streptinomyces avermitilis G-8,筛选得到ave D基因失活的基因工程菌G8-17。结果发酵结果表明,G8-17不产维菌素A组分,而B组分的发酵单位则有相应的提高,其中有效组分B1a的发酵单位提高了33.6%。结论 ave D基因内部片段倒位没有影响下游与之共转录的基因ave F的表达,同时能有效阻断阿维菌素A组分的产生,提高B组分的发酵单位。

鼠伤寒沙门菌damX基因产物是一个内膜蛋白并参与胆汁抵抗

鼠伤寒沙门菌damX基因产物是一个内膜蛋白,DamX蛋白在SDS-PAGE电泳中迁移率相当于70×103,但理论值为46×103。DamX蛋白的合成发生在对数生长期和平台期。damX基因破坏,导致严重的胆汁敏感性。外膜蛋白As mA的缺失,抑制沙门菌damX突变株的胆汁敏感性。

基因疗法挽救绝症少年

现年16岁的英国男孩雷米天生患有慢性肉芽肿病。此病患者的一个出错基因破坏了一小套免疫细胞——嗜中性白血球，而这些白血球是人体抵御感染的第一道防线。

低双乙酰啤酒酵母工程菌的构建

利用PCR技术以啤酒酵母QY的染色体为模板扩增出含有乙酰羟酸合成酶 (AHAS)基因ILV2的片段 ,将ILV2基因的内部EcoRI片段连接到整合载体YIp5上 ,并在该载体的BamHI -SalI位点插入铜抗性基因CUP1-MT1,构建了YIpCE质粒 ,将其转化啤酒酵母QY ,所得到的转化子AHAS酶的活力比受体菌QY降低75 %左右 ,在发酵测试中 ,转化了产生双乙酰的量比原始菌株降低 30 %。

后熟期短的酿酒酵母工程菌构建

借助质粒pBluescriptM13-,以淀粉酶基因(AMY)为筛选标记构建乙酰乳酸合成酶基因(ILV2)的重组整合质粒pMGI。用重组质粒pMGI所含ilv2∷AMY嵌合基因片段转化工业酿酒酵母菌Sc11,获得转化子(Sc11-ilv)。Sc-11-ilv不含细菌载体序列和酵母抗药性标记,所表达的乙酰乳酸合成酶活性降低30%;模拟发酵实验表明Sc11-ilv发酵液的双乙酰含量降低70%,Sc11-ilv发酵性能保持不变,遗传稳定性为100%,可以比较安全地用于啤酒生产。

自交衰退新解

本文在综合基因组学、系统生物学、现代分子生物学最新发展的基础上,提出了遗传物质缺失致使自交衰退新假说。遗传物质缺失致使自交衰退假说认为:由于同源染色体遗传物质存在差异,存在差异的遗传物质在自交后有不存在于自交子代的可能,从而造成自交子代相对于亲本的遗传物质缺失,致使自交子代衰退。本文通过一个实例论证这一假说,并运用这一假说解释三个遗传学现象。最后,比较隐性有害基因纯合致使自交衰退和多基因平衡破坏致使自交衰退学说的错误,并从遗传物质缺失致使自交衰退的角度解析了杂种优势。

超声介导微泡破坏结合慢病毒载体介导人connexin43基因的骨髓间充质干细胞归巢治疗心肌梗死

目的探索超声介导微泡破坏结合慢病毒载体介导人connexin43基因的骨髓间充质干细胞归巢治疗心肌梗死的有效性。方法将20只造模犬随机分为两组,每组10只,分别为实验组(超声+微泡+connexin43基因转染BMSCs组),对照组(超声+微泡+未转染BMSCs组),比较造模后4h和造模后28d,两组LVEF、DA、FS、WMSI的变化。结果造模后28d,实验组较对照组心功能明显改善(LVEF对比,t=5.4976;DA对比,t=4.0681;FS对比,t=4.4229;WMSI对比,t=2.8844),P<0.05,差异具有统计学意义。结论 Connexin43基因转染BMSCs较未转染的BMSCs能更有效的改善心肌梗死的心功能,具有进一步研究的价值。

致病菌烟曲霉新基因Afu4g13170生孢致毒相关性初步研究

【目的】对烟曲霉Afu4g13170基因功能进行初步研究。【方法】利用Double-jointPCR方法和一步基因敲除技术,构建Afu4g13170基因缺失突变株。【结果】序列比对表明烟曲霉Afu4g13170蛋白与构巢曲霉Ani04163蛋白和新型隐球菌Gib2蛋白的氨基酸序列相似性为88.6%;表型分析表明基因破坏使突变株生长迟缓、梗基伸长、孢子分化能力下降,产孢推迟、产孢量减少,色素产生量降低;色谱分析显示基因缺失突变株的产毒能力下降。【结论】烟曲霉Afu4g13170基因可以作为控制曲霉致毒的一个靶位点。

链霉菌M1033同源重组葡萄糖异构酶缺陷型菌株的构建

为实现有工业生产价值的葡萄糖异构酶双突变体酶GI(G1 38P G2 47D)的稳定高效表达 ,在建立 7号淀粉酶链霉菌M1 0 33原生质体转化条件的基础上 ,构建了含 6 0 0bp不完整GI(G1 38P G2 47D)结构基因片段的插入型同源重组质粒pXW ,并通过同源重组模式整合到M1 0 33的染色体上 ,实现了GI基因的破坏 (genedisruption) ,获得了同源重组葡萄糖异构酶缺陷型菌株 .对同源重组片段的分析 ,突变引入的验证以及缺陷型菌株稳定性的检测证实了以此方法在染色体上引入突变的可行性 .

睡眠有助防癌

美国一位科学家得到的研究结果显示,良好的睡眠可以帮助人们避免患上癌症.美国斯坦福大学医学中心的斯皮格尔教授在《大脑、行为和免疫》杂志上发表文章指出,睡眠可以影响人体荷尔蒙的平衡,而荷尔蒙失调会对一个人是否患上癌症产生影响.