籼稻品种H359基因组可转化人工染色体(TAC)文库的构建

构建能够通过农杆菌介导转化植物的人工染色体文库可以加快突变基因的精细定位和克隆的速度。为了克隆水稻突变基因的需要 ,我们利用pYLTAC7载体构建了籼稻品种H35 9基因组的TAC文库。该文库包含 4 10 88个克隆 ,保存在 10 7块 384孔板中。插入片段大小在 5 0 - 10 0kb之间 ,平均插入大小为77kb ,推测该库覆盖水稻基因组接近 7 4倍。

小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系可转化人工染色体(TAC)文库的构建

可转化人工染色体 (Transformation competentArtificialChromosome ,TAC)是具有克隆和转移大片段基因能力的新型载体 ,是植物基因克隆和转化的有效工具。为了克隆小麦抗白粉病基因和其它基因 ,本研究用TAC载体 pYLTAC17构建了带有抗白粉病基因Pm2 1的小麦 簇毛麦 6VS/6AL易位系的基因组DNA文库。该文库包含2 10万个克隆 ,平均插入片段 35kb ,库容相当于普通小麦基因组的 4 9倍。本文库以约 10 0 0个克隆组成 1个混合池的方式保存在 2 2块 96孔平板 ,可用PCR方法进行文库的筛选。

抗黄矮病小麦-中间偃麦草易位系基因组可转化人工染色体文库的构建及初步筛选

利用抗黄矮病小麦－中间偃麦草易位系HW642的细胞核DNA构建了一个可转化人工染色体（transformation-competent artificial chromosome,TAC)文库，文库由2．3×10^6，克隆构成，重组率为90．48％，平均插入片段大小为22kb左右，约覆盖普通小麦单倍体基因组2．5倍，在该文库中分离得到单拷贝DNA序列的几率约是95．77％，文库保存24块96孔板中，每个孔中约含有1000个不同的重组克隆，可以采用Pooled PCR的方法对文库进行筛选，用来源于小麦的简单重复序列（simple sequence repeat,SSR)引物wms37扩增中间偃麦草，抗病易位及感病材料，得到一条与抗性共分离的特异条带，约450bp,将此特异标记条带转化为SCAR（sequence characterized amplified region)，标记，用于筛选HW642基因组TAC文库，得到12个阳性克隆， 对阳性克隆进行了PCR－Southern验证，以中间偃麦草基因组部DNA为探针与限制酶Hind Ⅲ消化后的阳性克隆杂交，其中10个阳性克隆分别有1－6条杂交带，结果表明，这10个阳性克隆可作为抗黄矮病相关基因筛选的候选克隆。

云南药用野生稻核基因组细菌人工染色体(BAC)文库的构建与分析

通过云南药用野生稻核基因组BAC文库的构建,保存处于濒危状态的云南药用野生稻遗传资源。该文库包含27500个克隆,随机挑取80个克隆检测,插入片段平均大小为80kb,文库容量相当于水稻基因组大小的5.1倍。

稻瘟病菌细菌人工染色体(BAC)基因组文库的构建

稻瘟病菌是一种重要的植物病原菌 ,同时又是研究植物和病原物之间相互关系的一个重要试验系统。实验通过采用 95 - 2 3- 4a稻瘟病菌株经提取纯化得到该稻瘟病菌的细胞核基因组总DNA ,用限制性内切酶部分酶解后 ,与经末端去磷酸化处理过的pCUGIBAC1质粒载体按一定摩尔比例相互连接 ,通过转化E .coliDH10B感受态细胞进而通过蓝白斑筛选挑取白色克隆从而构建了 95 - 2 3- 4a稻瘟病菌株的细菌人工染色体 (BAC)基因组文库。通过进行酶切检测及Southern杂交分析后确定所构建的BAC文库平均插入片段 2 9.1kb ,该文库覆盖 7.4倍基因组 。

黑龙江野鲤细菌人工染色体基因组文库构建

为了开展鲤基因组研究,深入研究遗传连锁图谱遗传标记的定位及数量性状的定位和克隆,并最终为分子育种提供服务,本实验构建了鲤的BAC基因组文库。通过采集黑龙江野鲤(Cyprinus caxpio haematopterus)全血细胞制备琼脂糖凝胶包埋块的方法获得了高分子量(HMW)DNA。通过BamHⅠ部分酶切和PFGE电泳分离选择获得100～300kb的DNA片段,用电洗脱和透析的方法对产物进行浓缩和纯化。纯化的HMWDNA连接到大小为7.2kb的克隆载体pEZBAC上。为了评估构建的文库的质量使用一系列引物对文库进行了验证。本研究首次构建黑龙江野鲤的BAC文库,该库含有46656个克隆,插入片段大小在50～300kb之间,平均大小在100kb左右,覆盖鲤全基因组2.45倍,调取任一基因的概率为90%左右。获得的BAC克隆,保存在378块96孔板和27块384孔板中。建立了高效稳定的2步3维PCR筛选黑龙江野鲤BAC文库的方法。本实验为今后进一步进行鲤的功能基因定位及染色体步行、BAC-FISH等研究工作打下重要基础。

细菌人工染色体基因组文库构建关键技术研究

基因组文库是进行分子克隆和基因结构与功能研究的基础,完整覆盖的基因组文库的构建,使基因组任何DNA片段的筛选和获得成为可能。细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome,BAC)与其它载体系统相比具有转化效率高、嵌合体少、插入片段易回收,高覆盖率、稳定性强,并且具有易分离和操作等特性等优点而被广泛应用。作为物种保护策略的重要部分,构建我国濒危动植物品种基因组BAC文库,对于其遗传资源的保护和研究具有非常重要的作用。在查阅大量国内外相关资料的基础上,就BAC基因组文库构建过程中载体的制备、高分子量DNA的制备、大片段DNA的回收、连接与电击转化、基因组BAC文库质量鉴定等几个重点、难点问题进行了详细的论述和分析,对于构建高分子量插入片段、高覆盖率和稳定性的基因组文库提供理论基础与技术支撑。

毛竹大片段双元细菌人工染色体基因组文库的构建

从毛竹Phyllostachys pubescens幼嫩叶片中提取纯化得到高质量的基因组DNA,经限制性内切酶BamH I对它们进行梯度酶切,脉冲场电泳选择合适酶切DNA片段,与脱磷酸化处理过的质粒载体pCLD04541按质量比3∶1相互连接,转化大肠杆菌Escherichia coli DH10B感受态细胞进行蓝白斑筛选,挑取白色克隆,获得重组率较高的阳性克隆,构建了含有104个克隆的双元细菌人工染色体(BIBAC)基因组文库,并通过脉冲场电泳检测分析后确定,所构建的毛竹BIBAC文库平均插入片段为105 kb,约覆盖5倍毛竹基因组。该文库的构建为毛竹基因组研究做好了前期的基础工作。

棉花线粒体基因组细菌人工染色体文库的构建

以P30A细胞质雄性不育系黄化苗为材料,采用蔗糖密度差速离心和不连续蔗糖密度梯度超速离心提取棉花线粒体,低熔点琼脂糖包埋和原位消化裂解的方法制备高分子量的线粒体DNA(mtDNA),经BamHⅠ,HindⅢ酶切和PCR扩增进行纯度鉴定,并对其进行部分酶切,酶切片段与载体连接,电击转入大肠杆菌DH10B中,成功的构建了棉花线粒体基因组BAC文库。该文库共挑取3 840个单克隆,平均插入片段大小为15.5 kb,覆盖率超过70倍,研究结果表明该基因文库具有较高的质量。

河豚鱼基因组细菌人工染色体文库的构建

目的研究模式生物——河豚鱼的基因组以及利用河豚鱼基因组"小而全"的特点研究人类基因组。方法以红鳍东方豚(Fugu rubripes)的精子DNA为材料,以pBelo BAC 11为载体,构建河豚鱼基因组的细菌人工染色体(bacterial artifi-cial chromosome,BAC)格式化文库(gridded library)。结果该文库包含23 040个克隆,分别保存在240块96孔细胞培养板中。经对100个随机抽样的克隆分析表明,插入片段平均大小为100 kb,因此,该文库相当于河豚鱼单倍体基因组(400Mb)的6倍,即6个库容量。酶切分析10个克隆证明,经100代繁殖其插入片段仍然稳定不变。结论该文库符合BAC基因组文库的所有要求。

细菌人工染色体基因组文库构建方法的改进

目的:建立一种改进的更简便、易操作的细菌人工染色体(BAC)文库构建方法。方法:在构建猪霍乱沙门氏菌基因组大片段DNA的BAC文库时,对改进的基因组BAC文库构建方法和常规的BAC文库构建方法进行比较。结果:利用改进的方法可简便快速地构建猪霍乱沙门氏菌基因组BAC文库。结论:使用2种方法构建BAC文库,其转化效率,以及在BAC克隆中插入的DNA片段的大小和BAC克隆的稳定性等都相同,从而表明改进的方法更简单、更方便,它能使BAC文库的构建更为高效。

可转化人工染色体(TAC)文库载体DNA的制备

对可转化人工染色体(TAC)pYLTAC747NH/sacB文库载体DNA的制备条件进行了较系统的摸索和研究。结果表明,该文库载体经碱裂解法提取、QIAGEN Plasmid Mini kit纯化后,可获得较纯净的载体DNA。对其闭环载体DNA分别用不同酶量的Hind III酶切处理,经琼脂糖凝胶电泳检测得出其最佳Hind III完全酶切条件为2 U Hind III/μg闭环载体DNA、37℃酶切30 min;分别用0.5 MBU和1 MBU HK脱磷酶/μg对其线性载体DNA进行脱磷处理,经电泳和载体自连产物电转化检测表明其适宜的完全脱磷条件为1 MBU HK脱磷酶/μg线性载体DNA,30℃脱磷1 h;将所制备的线性载体DNA与λDNA/Hind III酶切片段进行连接,连接产物转化频率较高,其电转化大肠杆菌DH10B感受态细胞频率可达到9.6×108。

双元细菌人工染色体基因组文库研究进展

酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)是伴随着人类基因组计划的实施而产生的,这些大片段基因克隆载体的应用推动了分子生物学、遗传学等学科的快速发展。以农杆菌介导的直接转化植物为代表的双元细菌人工染色体(BIBAC)载体的发展,加速植物基因组的研究,成为植物基因组分析、基因功能鉴定、染色体结构与功能关系研究的重要工具。介绍了人工染色体文库的发展史,根据建库经验,着重阐述了BIBAC文库的构建、鉴定与应用。

基因组细菌人工染色体文库(BAC)的构建及应用

细菌人工染色体 (BAC)是一种承载DNA大片段的克隆载体系统 ,用于人、动物和植物基因组文库构建。BAC具有插入片断大、嵌合率低、遗传稳定性好、易于操作等优点。BAC文库的构建是基因组较大的真核生物基因组学研究的重要基础 ,可用于真核生物重要基因及全基因组物理作图、重要性状基因的图位克隆、基因结构及功能分析。本文主要综述了细菌人工染色体的构建与其鉴定 ,及其在物理图谱构建、图位克隆、转基因技术等研究上的应用。

我国濒危家养动物细菌人工染色体基因组文库的构建及应用

细菌人工染色体 (BAC)是新近发展起来的一种载体系统 ,具有克隆容量大 ,遗传特性稳定 ,转化效率高 ,易于操作等优点。在基因组文库构建和基因的快速克隆等方面已得到广泛应用。濒危家养动物细菌人工染色体基因组文库构建的目的在于有效、永久保存和利用其基因资源、快速克隆重要经济和抗逆性状基因以及为广泛、深入开展分子生物学研究提供宝贵的材料。

中国南荻基因组大片段人工细菌染色体文库的构建

以二倍体中国南荻为实验材料,以pIndigoBAC536-S为载体,以HindIII为限制性内切酶,经过载体的制备、高质量大片段DNA的获得、部分酶切最佳条件的确定、2次大片段选择和连接转化等过程,成功构建了中国南荻人工细菌染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)文库。该文库共包含130 560个克隆,空载率为2%,同时构建了340个超级池,便于以后针对目的基因片段的BAC筛选。对随机挑取的100个单克隆检测,结果显示,插入片段分布集中,平均大小为106kb,覆盖了南荻基因组的5.6倍。随机挑取的5个克隆经过100代左右的繁殖,DNA的酶切图谱保持一致,表明BAC克隆的稳定性良好。该文库能够为该品种的基因组研究提供1个有效的平台,将对芒属植物优良基因的克隆、基因组物理图谱的构建以及比较基因组学等方面的研究发挥重要作用。

小粒野生稻可转化人工染色体文库初步构建及筛选

以小粒野生稻核DNA为材料构建了一个可转化人工染色体文库,获得了5000个克隆,平均插入片段约45 kb。稳定性检测结果表明,小粒野生稻基因组DNA能够在TAC载体中稳定存在。基于已克隆抗性基因的保守序列设计探针,利用菌落杂交的方法,对文库进行筛选。结果表明,该文库可以用于抗性基因的筛选。

可转化人工染色体文库研究进展

综述了可转化人工染色体(transformation-competent artificial chromosome,TAC)载体的发展、TAC文库的构建程序及TAC载体系统在植物基因克隆中的应用。

可转化人工染色体文库的构建与鉴定

随着人类和植物基因组计划的实施,能容纳大片段的人工染色体载体发展迅速。而用YAC、BAC和PAC等基因组文库进行目的基因的筛选,在获得候选克隆后,通常要进行亚克隆,然后对每个亚克隆逐一进行基因功能互补试验,不仅工作量大,而且有遗漏目的基因的危险。TAC载体含P1质粒和Ri质粒的复制子,可直接转化植物,大大加速了工作进程。概括性的叙述了TAC载体的发展,TAC文库构建的程序及文库鉴定的问题。