枯草芽孢杆菌整合载体的构建及基因组的改造

构建了两种整合载体,分别为单交换整合载体pACC-BdbDC和双交换整合载体pDsbE,pDGC,转化野生型枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis168,目的基因整合到基因组上,同时引入氯霉素抗性基因。利用FLP/frt重组系统将氯霉素抗性基因敲除,便于宿主菌的进一步改造。PCR结果表明共重新构建了6种宿主菌。复杂双交换整合载体pDGC成功将3个目的基因整合到基因组上,为多个基因同时整合提供了一种方便可行的方法。

耐高温工业酿酒酵母的筛选和发酵性能

研究的主要目的是筛选发酵性能较为可靠的工业酿酒酵母,通过选用环境适应能力较强的工业酿酒酵母来控制发酵成本,提高工业生产的经济效益。将在生产线中被分离出的工业酿酒酵母作为研究菌株,主要采取实验室进化和基因组改造等方式对耐受能力较强的酿酒酵母菌株进行筛选。之后采取摇瓶验证的措施来验证其发酵性能,研究发现其中S.CD 12的发酵性能较为突出,与对照菌株相比,在工业物料中的发酵性能更好,为能进一步检验其发酵性能,针对其在不同工业物料中的发酵性能表现进行验证和综合评估。

小鼠的遗传学研究

自20世纪初,小鼠的遗传学研究从宠物农场进入哈佛大学的实验室只有短短一百年的历史;但是,由于小鼠基因组与人类基因组高度同源、小鼠基因组改造手段非常成熟以及小鼠近交系、突变系和工具小鼠品系种类繁多,小鼠遗传学已成为发育生物学、功能基因组学和疾病机理研究的核心研究领域,小鼠也成为最重要的模式生物之一。近年来,随着小鼠基因组序列测序的完成,不同小鼠近交系品系特异的微卫星标记或单核苷酸多态性不断被发现,小鼠生理生化表型分析手段和数据也越来越完善,这些前期工作导致了目前大规模的基因剔除计划、基因突变计划及构建和分析重组近交系计划的实施。这些计划可能构成未来10￣20年中生命科学和医学研究领域的最重要的内容之一。

耐高温工业酿酒酵母的筛选和发酵性能研究

以工厂生产线中分离得到的工业酿酒酵母为出发菌株,通过基因组的改造和实验室的适应性进化,在30%葡萄糖、8%乙醇、40℃下筛选获得了5株耐受性较强的酿酒酵母菌株。通过摇瓶验证其发酵性能发现,其中S.C D12在工业物料中的发酵性能显著优于对照菌株。为了进一步对S.C D12进行发酵性能的综合评估,对其在不同工业物料中的发酵性能进行了测试,结果显示其在不同的工业物料中均具有良好的发酵稳定性,乙醇产量显著高于对照菌株,发酵残糖较对照菌株极低。最后进行了工业物料小试验证,在35℃下乙醇产量可达到12.50%vol,较出发菌株提升了0.53%vol。S.C D12的发酵性能与对照菌株在32℃下发酵性能相当,能极大的节省工业冷却水的使用,具有一定的工业应用价值。

含非天然氨基酸定点突变的MLL3_(SET)蛋白表达与纯化

在组蛋白H3K4甲基转移酶MLL3的催化结构域(MLL3_(SET))中定点引入非天然氨基酸N-炔丙基赖氨酸(N-propargyl-lysine,PrK),表达、纯化该突变蛋白(MLL3_(SET)*),并评估突变蛋白的酶活,为后续进一步利用单分子荧光共振能量转移技术(smFRET)表征MLL3的作用机制奠定基础。将MLL3_(SET)接入pET-28b(+)构建表达载体,通过MLL3_(SET)晶体结构分析选择N4905位点进行PrK的引入;对商业化菌株(C321.ΔA.exp)进行基因组改造以引入T7 RNA聚合酶基因,并在改造后的菌株中表达、纯化MLL3_(SET)^(*),最后测定MLL3_(SET)^(*)的酶活性。结果表明,在构建的C321.ΔA.exp lacZ∷T7p07菌株中,pET28b-MLL3_(SET)^(*)在共转入aaRS-tRNA正交系统以及外源添加PrK后能够正常表达;通过Ni-NTA亲和层析及凝胶过滤层析成功纯化出高纯度的MLL3_(SET)^(*)蛋白;多酶级联反应结果显示,MLL3_(SET)^(*)的酶活性比野生型蛋白低,但仍具有约43%的甲基转移酶活性。本研究成功实现了含PrK的MLL3_(SET)蛋白的原核表达与纯化,突变蛋白保留了一定酶活性,为后续深入研究MLL3的分子机制奠定了基础。

高通量筛选ENU诱变产生的遗传疾病小鼠模型

由于小鼠和人类基因组的高度同源,修饰和改造小鼠基因组已经成为建立人类疾病模型和研究基因功能的最重要的手段.通过C57BL/6J雄性小鼠的ENU化学诱变和子代的表型筛选的方法,对G_1代3172只小鼠的形态学、行为学、神经功能、学习记忆、听力、视觉生理、骨代谢、血糖和心功能等一系列生理生化指标进行了高通量检测,筛选出595只与人类疾病相关的显性基因突变个体,其中毛色转换、眼疾和听力缺陷发生频率较高,而代谢性异常的显性突变率较低,提示血糖和心电等重要代谢功能的遗传调控稳定性高于外周神经系统功能.小鼠单侧性眼疾存在明显的雌雄不均一性和左右不对称性.骨密度异常与小鼠性别也有一定相关性.在对104只G_1代突变小鼠和野生型小鼠交配的可遗传性检测中,已有14只的异常表型被确认可以遗传,其中行为学异常小鼠的可遗传性较低,提示行为学异常可能和多基因突变相关.这些突变小鼠品系的建立,为疾病表型的发生和病理过程的细胞生物学及分子生物学机制研究、突变基因的染色体定位和克隆奠定了良好的基础.