用cDNA-AFLP技术构建基因组转录图谱

以分离群体mRNA反转录的cDNA为模板进行AFLP分析 ,在保留AFLP多态性丰富、稳定性高、无需了解序列信息等优点的同时 ,集中显示基因组表达序列的多态性差异 ,已逐渐发展成为基因差异表达显示、表达基因遗传连锁作图和基因克隆的常用方法。本文介绍了作图群体组配、总RNA提取与mRNA分离、cDNA合成、AFLP分析、转录图谱多态性分析作图等cDNA AFLP分析的主要技术。

蛋白激酶C_ζ对小鼠受精卵发育早期基因组转录活化的影响

为研究蛋白激酶Cζ (proteinkinaseCζ ,PKCζ)在小鼠受精卵细胞早期发育过程中对胚胎基因组活化影响 ,采用免疫印迹和细胞免疫荧光的方法 ,观察PKCζ的抑制剂对小鼠受精卵 1 细胞期G1和G2 不同时期小鼠受精卵基因组活化的影响 .小鼠 1 细胞期受精卵蛋白激酶C (PKC)的活性不断增加 ,并在G2 期达到最高 .PKC的抑制剂calphostinC可以明显抑制PKC的活性达 4 7% .同时calphostinC对受精卵 1 细胞期基因组的早期活化具有显著的抑制作用 (P <0 0 1) .在小鼠 1 细胞期受精卵的G2 期 ,具有活性的磷酸化PKCζ的含量明显多于G1期和卵母细胞MⅡ期 ,分别比它们高2 7%和 110 % .PKCζ的特异性抑制剂可以抑制受精卵 1 细胞期基因的转录和活化 (P <0 0 5 ) .实验结果表明 。

基因表达的系统分析在基因组转录谱研究中的应用

基因表达的系统分析技术 (SAGE)是一种全面分析基因表达模式的实验方法。该方法的原理是基于分离出每一m RNA所特有的长 9bp～ 14 bp的标签并将其串联起来进行克隆和测序。该方法不仅可以给出我们一个全面的特定细胞或组织的基因表达谱 ,而且还可以通过对两组处于不同环境中的同一类型细胞的基因表达谱进行比较 ,帮助我们发现那些由于环境的变化而表达发生改变的基因。本文拟就这一高通量方法的原理、应用。

单股正链RNA病毒基因组3'非编码区功能

单股正链RNA病毒数量众多,对人、动物和植物造成很大的危害。病毒基因组3'末端都具有一段非编码区,基因组3'非编码区在病毒的复制过程中发挥着重要的作用。本文简单介绍了单股正链RNA病毒基因组3'非编码区结构的预测、测定和功能的研究方法,并重点概括了不同单股正链RNA病毒3'非编码区一级序列、茎-环结构、假结体、TLS等结构在病毒基因组的复制、转录和翻译中的调控作用以及目前存在的问题。

白头叶猴食叶适应相关的特定基因和通路的多组学研究

探究基因组及转录机制在白头叶猴(T. leucocephalus)食叶适应中的潜在作用,为后续保护工作提供理论依据。方法 我们对广西地区2只白头叶猴的12份样本进行了高通量测序并构建系统发育分析。结果 与14种灵长类动物基因组相比,有35个基因组显著扩增的基因家族与基础代谢、能量产生和外源性生物降解相关。这些扩增的基因家族在多种组织中表达。并且,我们也发现了一些与味觉、嗅觉和食物选择相关的收缩基因家族。结论 这些显著扩增的基因家族,主要参与基础代谢和能量代谢,增强了白头叶猴对叶片的消耗,促进了能量的产生,以适应叶片缺乏时的低每日能量生产。同时,为了适应食叶的需求,白头叶猴的收缩基因家族也出现了相应的进化。

新型宏基因组/宏转录组学技术在反向病原学研究中的应用

以微生物组学和宏基因组学为基础的新技术的飞跃式发展为新微生物的发现提供了无可比拟的优势。反向病原学理念公开提出后,在指导新发突发传染病的主动防控实践方面也正在发挥越来越多的作用,在公共卫生和疾病防控领域应用越来越广。新型宏基因组/宏转录组学技术进一步支撑和促进反向病原学研究,在发展评估新微生物致病潜力的理论、策略和方法方面有了一定的进展。在此,本综述梳理了新型宏基因组/宏转录组学技术在反向病原学研究中的作用实践、以及面临的挑战,期望促进人们对病原体的认识和理论技术创新。

牛分枝杆菌感染巨噬细胞（THP-1）全基因表达谱变化的研究

目的分析可用于牛结核病免疫学诊断的后选靶标，同时初步探讨由牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）引起人结核病的免疫学发病机制。方法牛分枝杆菌（AF2212／97）和结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis（H37Rv））感染人的模式巨噬细胞（THP-1），采用含有22000个基因全长的基因芯片分析感染72个小时后的THP-1细胞全基因组在转录水平的表达谱变化。在确定所分析的芯片的特异性和稳定性均达到要求的基础上，通过GO显著性统计分析，研究表达变化的基因所对应蛋白的分子功能、生物过程以及细胞组分;进一步采用Pathway显著性统计分析，研究表达差异蛋白之间的相互作用。结果感染H37Rv后的THP-1细胞，存在290个差异基因表达，其中170个上调表达，120个下调表达，与以往的结果类似。牛分枝杆菌感染的THP-1细胞中有1899（8．6％）个基因差异表达，其中1075个基因被上调表达（56．6％），其它43．4％被下调。1899个基因中1674个在GenBank有记录，263个是新基因，基质金属蛋白酶12（H200000442）被上调达60．4921倍;下调幅度最大的蛋白丝氨酸／半胱氨酸抑制酶（H200006177）被下调6．29倍。采用GO分析发现，这些基因对应的多为炎症因子蛋白、凋亡蛋白、细胞外基质蛋白、T细胞受体信号通路相关蛋白等。其中与炎症相关的的蛋白有47个，如TNF、IL8、CXCL3、CCL8、CCL7、IFNK、IL-26、CCL28等。随后的Pathway分析差异表达基因对应的2014个蛋白，展示了一系列引起结核病发病的重要信号传导通路。结论基因表达谱研究可为牛结核病发病机制及其诊断研究提供大量有益的生物学信息。

影响非洲猪瘟病毒对培养细胞感染性的因素分析

猪原代肺泡巨噬细胞(PAMs)是非洲猪瘟病毒(ASFV)的主要靶细胞,除宿主单核/巨噬细胞外,ASFV难以在其他体外细胞系中持续生长繁殖。本研究旨在研究影响ASFV在体外感染能力的因素。通过比较ASFV接种易感细胞PAMs和非易感细胞系3D4/21、PK15细胞的全基因组转录谱差异;使用小分子药物改变细胞代谢或周期、物理方法改变细胞黏附;通过荧光定量PCR、Western blot、红细胞吸附检测病毒在3D4/21和PK15细胞系中的增殖情况。结果表明:ASFV接种3D4/21和PK15两种细胞与PAMs细胞的共同差异基因显著富集在细胞黏附、细胞周期和细胞代谢等方面;使用多种调控细胞周期、细胞代谢的小分子药物处理细胞后对ASFV感染PK15和3D4/21细胞的能力无显著影响;通过悬浮培养来调节细胞的黏附后,显著提高ASFV感染PK15和3D4/21细胞的能力,但随着传代次数的增加,病毒的复制能力逐渐下降。综上所述,细胞黏附可能是影响ASFV体外感染能力的重要因素之一,但是改变细胞黏附后并不能维持ASFV的复制能力。本研究为ASFV体外细胞系的建立提供了初步参考。

应用Gelatin和3D培养验证细胞粘附对传染性支气管炎病毒在体外培养细胞中增殖的影响

除传染性支气管炎病毒(IBV) Beaudette株外,其它IBV均难以在体外细胞系中传代培养。为研究限制IBV体外传代培养的影响因素,本研究应用流式细胞术检测IBV经典株M41囊膜与宿主细胞膜融合程度,结果显示M41可以在体外培养条件下侵入鸡细胞系LMH和DF-1,但荧光定量PCR检测显示侵入的M41无法增殖。进一步通过对比分析M41易感组织气管、非易感组织脾脏及LMH细胞全基因组转录谱数据,结果显示宿主细胞粘附、细胞周期、p53及SRC可能是M41在体外培养细胞中增殖的宿主决定因素。本研究通过在2D培养体系中预先孵育Gelatin和3D培养两种方式来调节细胞粘附的物理环境,结果显示两种方法均可以促进M41在体外培养细胞中的增殖;利用多种经典的细胞周期抑制剂及p53和SRC活性调控分子预先处理LMH和DF1,显示细胞周期、p53活性及SRC活性对IBV体外增殖无显著影响。表明细胞粘附特性是影响IBV体外增殖的重要因素。本研究为IBV体外细胞培养体系的建立奠定了实验基础。

分子生物学方法在环境微生物生态学中的应用研究进展

随着分子生物学方法的不断发展和改进,微生物在生态系统中的作用被更好的挖掘出来。目前快速发展的先进的分子生物学技术,已经开始应用于分析环境微生物的多样性、微生物的生物地理学及微生物对气候变化的响应等。一般环境微生物的研究目标主要有3个,即确定微生物的种类和多样性、微生物的功能或潜在作用及在特定时间点活跃的微生物等。然而,现有微生物的研究方法复杂多样,容易给研究者在方法的选择上带来困惑。将从微生物的多样性和功能研究两个方面介绍和分析相应的分子生物学方法,尤其是近年来快速发展的高通量测序、宏组学和单细胞水平研究方法(如纳米二次离子质谱与荧光原位杂交相结合的方法)等新技术及其应用情况,以期为研究者选择合适的研究方法进行环境微生物的研究提供依据。

RNAi的革命

通过实验手段向细胞内导入长的双链RNA或者转基因可以产生一些短片段的双链RNA,这些短片段的双链RNA可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异地阻断体内特定基因的表达,使细胞出现特定基因缺失的表型,称为RNA干扰(RNA interference,RNAi)。SiRNA(small interference RNA)就是这种短片段双链RNA分子,能够以序列同源互补的mRNA为靶目标,降解特定的mRNA。基本上所有的生物体内也都存在一种内源的小分子RNA,为单链RNA,由基因组转录生成,但是不编码蛋白质,它们的功能在于调节mRNA的翻译,称为miRNA,是由具有发夹结构的前体剪切产生的。RNAi的发现具有划时代的意义,它不仅揭示了细胞内基因沉默的机制,而且有望成为后基因组时代基因功能分析的有力工具,极大地促进了人类揭示生命奥秘的进程。

第一届DNA甲基化与疾病的精准诊治:机遇和挑战国际研讨会

DNA（主要是CpG的）甲基化是其遗传机制和表型效应最为明确的表观遗传性机制。DNA甲基化谱式的变化不仅指导在正常发育过程中细胞谱系特化所依据的基因组转录谱式的改变,且在疾病发生和发展的基因表达异化中起着决定性的作用。DNA是远比RNA、蛋白和小分子代谢物稳定的生物标志物,其所携带的遗传（突变,融合和拷贝数变异）和DNA甲基化状态的信息在疾病的诊,治方面有着更好的前景。

第一届DNA甲基化与疾病的精准诊治:机遇和挑战国际研讨会

DNA（主要是Cp G的）甲基化是其遗传机制和表型效应最为明确的表观遗传性机制。DNA甲基化谱式的变化不仅指导在正常发育过程中细胞谱系特化所依据的基因组转录谱式的改变,且在疾病发生和发展的基因表达异化中起着决定性的作用。DNA是远比RNA、蛋白和小分子代谢物稳定的生物标志物,其所携带的遗传（突变,融合和拷贝数变异）和DNA甲基化状态的信息在疾病的诊,治方面有着更好的前景。在过去几年内,DNA甲基化分析的基础和临床转化研究有了突出的进展。