乙型肝炎病毒基因组C区启动子突变位点新型检测方法的建立、验证及初步应用

目的 利用错配扩增和荧光PCR技术,建立一种针对乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）基因组C区启动子（basal core promoter,BCP）1762/1764突变位点的新型检测方法,并对该方法进行验证及临床评价。方法 根据NCBI登录的HBV A-H型基因序列（以GenBank号为AB033556.1的C基因型作为标准参考序列）合成野生型和突变型标准品序列,测序后连接至pMD-18T载体上,构建质粒标准品,设计引物、探针及合适的突变检测体系,确定检测的线性范围;对建立的方法进行灵敏度、重复性、特异性、稳定性验证;分别用本实验建立的ARMS-PCR法和基因Sanger测序法（金标准）检测132份慢性乙型肝炎患者血液样本的基因位点是否发生突变,并分析ARMS-PCR法的灵敏度和特异度。结果ARMS-PCR法能检测1 × 10^2- 1 × 10^9 copies/ml的野生型和突变型质粒;野生型和突变型样本检测的Ct差值（驻Ct）在7以上,且能检出最低达1%突变含量的混合质粒和样本;该方法灵敏度较高,重复性、特异性、稳定性良好;其检测132份慢性乙型肝炎患者血液样本1762/1764位点突变阳性率为41.7%,明显高于Sanger测序法检测结果（P〈0.05）。结论 建立的ARMS-PCR法能很好地用于评估乙肝患者患肝癌的风险,且较Sanger测序法检测精度更高,更适合于临床推广。