脐橙基因组DNA文库的构建

研究构建了一个脐橙基因组DNA文库。以‘大山岛’脐橙幼叶为试材 ,CTAB法制备基因组DNA ,经CsCl密度梯度离心纯化 ,获得了大片段 ( >10 0kb)高纯度基因组DNA。以Sau3AI部分酶切 ,酶切片段 3’凹端不完全补平后与LambdaGEM 12XhoIHalf SiteArms连接 ,连接产物用Packagene Extract包装 ,所得噬菌体在KW2 51寄主上铺平板。文库经过扩增并保存。对该文库特性研究表明 ,该文库包含了 2 .15× 10 6个单个克隆 ,背景低于10 0pfu/ μgDNA ,插入片段平均大小约为 17kb ,证明是一个较为完整的脐橙基因组DNA文库。

猕猴桃基因组DNA文库的构建

采用改良CTAB法提取美味猕猴桃(Actinidiadeliciosacv.Bruno)基因组DNA,经CsCl密度梯度离心纯化后用Sau3AI部分酶切,通过透析袋电泳的方法分级回收,剔除14kb以下的片段,回收长为14～23kb的酶切片段。部分酶切片段经dATP和dGTP部分补平后与LambdaFIXII载体连接,连接产物用GigapackⅢPackagingExtract进行包装,最后得到含有1.05×106pfu的基因组文库,扩增后文库滴度为2.5×109pfu/mL。利用6对根据植物基因保守区或猕猴桃基因序列设计的专一引物对基因组文库和基因组DNA进行PCR扩增,均得到与预计长度相符的目的基因片段。

猪肺炎支原体基因组DNA文库的构建

将猪肺炎支原体Z菌株接种于A2 6液体培养基中培养 ,在收获菌体细胞后 ,提取和纯化其基因组DNA。并经EcoRI大量酶切获得 4 .0～ 8.0kb的DNA片段 ,与λgt11载体臂连接为重组λDNA ,然后进行包装 ,感染于Y10 90宿主菌 ,构建了猪肺炎支原体基因组DNA文库 ,并得以表达。

结核分枝杆菌T7噬菌体展示基因组DNA文库的构建与鉴定

目的利用T7噬菌体作为载体,构建结核分枝杆菌的基因组DNA文库。方法提取MTB的基因组DNA,用EcoR I和Hind III进行双酶切,以对基因组DNA进行片段化,并在其末端加上定向的EcoR I和Hind III黏性末端,用DNA片段纯化分离柱除去小于200bp的片段和多余接头。将DNA片段与T7 10-3b噬菌体连接,经包装蛋白进行包装后转入BLT5403宿主菌以构建T7噬菌体展示基因组DNA文库,并检测文库的滴度和随机性。结果成功提取到较高质量的MTB基因组DNA;构建的T7噬菌体展示基因组DNA文库的滴度约为6×106 pfu/cm3;用PCR检测结果表明,在随机挑取的16个噬菌斑中,其重组率为100%,且插入片段都介于250~2 000bp左右。结论成功构建了MTB T7噬菌体展示基因组DNA文库,为从基因组范围筛选MTB的优势抗原奠定了前期实验基础。

新疆中麻黄基因组DNA文库的构建

目的:构建新疆中麻黄(EphedraIntermedia)的基因组DNA文库。方法用Sau3AI对所提新疆中麻黄基因组DNA进行酶切,回收15-23Kb之间的酶切产物片段,然后与LambdavectorBamHIArms进行连接、包装形成文库,计算文库重组噬菌体滴度、包装效率。结果,所建文库的重组噬菌体滴度为1×106pfu/ml、包装效率为2×106重组子/μg载体DNA。结论成功构建了基因组DNA文库,为进一步研究奠定了基础。

新疆管花肉苁蓉DNA片段的克隆、序列分析及其基因组DNA文库的构建

根据新疆肉苁蓉的RAPD分析结果，结合新疆肉苁蓉的有效成份及药用价值，筛选出新疆肉苁蓉的优良种质—管花肉苁蓉。对新疆管花肉苁蓉517bp的DNA片段进行了克隆、序列测定与分析，构建了新疆管花肉苁蓉的基因组DNA文库。

卫氏并殖吸虫基因组DNA文库构建Ⅱ．基因组DNA文库的构建及鉴定

以ＥｃｏＲＩ酶切安徽地区卫氏并殖吸虫基因组ＤＮＡ，电泳分离回收０．４～４ｋｂ的ＤＮＡ片段。与ＥｃｏＲＩ酶切并经牛肠碱性磷酸脂酶处理的大肠杆菌质粒ｐＵＲ２２２载体，在Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用下重组连接，构建卫氏并殖吸虫基因组ＤＮＡ文库，获得１．０８×１０６个重组克隆。经重组克隆质粒的快速鉴定和卫氏并殖吸虫基因组ＤＮＡ探针菌落原位杂交证实，重组克隆中含有与卫氏并殖吸虫基因组ＤＮＡ同源的ＤＮＡ插入片段，并初筛到１９个阳性重组克隆。表明卫氏并殖吸虫基因组ＤＮＡ文库构建成功。

新疆甘草DNA片段的克隆、序列分析及其基因组DNA文库的构建

目的克隆新疆甘草DNA片段 ,构建新疆甘草基因组DNA文库。方法对新疆产 4种甘草进行随机扩增多态性DNA(RAPD)分析 ,回收甘草随机引物s12 1的PCR产物中 5 0 0bp左右的带 ,克隆到pMD18 T载体中 ,经电泳鉴定后测定序列 ,进行序列分析。用Sau3AI对所提新疆甘草基因组DNA进行酶切 ,回收 15～ 2 3kb之间的酶切产物片段 ,然后与LambdavectorBamHIArms进行连接、包装形成文库 ,计算文库重组噬菌体滴度、包装效率。结果获得了甘草 4 90bp的DNA片段 ,所建文库的重组噬菌体滴度为 3× 10 6pfu/ml、包装效率为 6× 10 6重组子 /μg载体DNA。结论成功克隆了新疆甘草DNA片段 ,并构建了基因组DNA文库 ,为进一步研究奠定了基础。

减蛋综合征病毒全基因组DNA文库的构建及物理图谱分析

Ｅ Ｄ Ｓ Ｖ Ａ Ａ２ 株纯化 Ｄ Ｎ Ａ 经 Ｈｉｎｄ Ⅲ、 ＰｓｔⅠ和 Ｓｐｈ Ⅰ水解后， 分别提取 Ｄ Ｎ Ａ 片段并克隆至ｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｋ Ｓ（ ＋ ） 和ｐ Ｇ Ｅ Ｍ３ Ｚｆ （ ＋ ） 载体， 构建了 Ｅ Ｄ Ｓ Ｖ 全基因文库。根据 Ｅ Ｄ Ｓ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ 片段和基因组 Ｄ Ｎ Ａ 电泳迁移率计算， Ｅ Ｄ Ｓ Ｖ 基因组大小为３２９ｋｂ ， 通过克隆片段酶谱鉴定， 杂交建立了 Ｅ Ｄ Ｓ Ｖ 限制性内切酶 Ｈｉｎｄ Ⅲ、 Ｐｓｔ Ⅰ和 Ｓｐｈ Ⅰ的物理图谱。

黑龙江镜鲤基因组DNA文库的构建

纯化镜鲤体组织的高分子量基因组DNA,经限制性内切酶Sau3A Ⅰ部分消化后,10％-40％蔗糖密度梯度离心分离并回收9—23kb的DNA片段。以λDASHⅡ为克隆载体,与9—23kb的DNA片段进行连接和包装,构建了镜鲤的基因组DNA文库。随机选取5个独立的噬菌斑,提取DNA后用EcoR Ⅰ与BamH Ⅰ进行酶切分析,证明克隆插入率为100％。经测定,该文库的滴度是108pfu/mL,根据公式N=ln(1-P)/In(1-f),99％的镜鲤基因组包含在该基因组文库中。以鲤IGF-Ⅱ基因探针对该基因组文库进行Southem杂交,筛选到相关的阳性克隆,证明这是一个较为完整的镜鲤基因组DNA文库。

毛足棒角蝗基因组DNA文库的构建

纯化毛足棒角蝗 (Dasyhippusbarbipes)虫体组织的高分子量基因组DNA ,经限制性内切酶Sau3AI部分消化后 ,10 %～ 4 0 %蔗糖密度梯度离心分离 10～ 2 0kb的DNA片段。以λEMBL3为克隆载体 ,与 10～ 2 0kb的DNA片段进行连接和包装 ,构建了毛足棒角蝗的基因组DNA文库。经测定该文库的滴度是 2× 10 5pfu/mL ,根据计算 ,99%的毛足棒角蝗的基因包含在该基因组文库中。

文库构建与基因簇靶向筛选驱动的微生物天然产物高效发现

微生物天然产物作为小分子药物的主要来源,已被广泛应用于医药与农业等领域。随着全球抗生素耐药性与其他公共健康问题的加剧,新结构、新靶点微生物天然产物发现迫在眉睫。大规模(宏)基因组测序揭示微生物蕴含了巨大的生物合成潜力,相继催生了多种不同类型的天然产物挖掘策略。然而,目前仍然缺乏将天然产物合成基因簇与编码产物快速关联的高效方案。近年来,(宏)基因组文库构建在获取批量天然产物合成基因簇方面展现出明显优势,结合高效的基因簇靶向筛选方法,显著加速了新结构天然产物系统发现。本文综述了三类基于(宏)基因组文库构建与靶向筛选驱动天然产物创新发现的策略,主要从克隆载体类型、文库构建方式、基因簇靶向筛选方法等角度进行了阐述,并对Cosmid/Fosmid文库、BAC/PAC文库、FAC/YAC文库等不同文库类型的优缺点及应用范围进行了对比,最后对这些策略的发展前景进行了展望。未来,基于文库构建与基因簇靶向筛选策略将极大驱动不同生境微生物来源的活性天然产物挖掘,预期大量新靶点、新结构天然产物将不断涌现。

中国对虾部分基因组文库构建和微卫星DNA序列的筛选

以中国对虾为实验材料，提取肌肉的基因组DNA。经Bsp143Ⅰ酶切后，回收500～1000bp的DNA片段，与经BamHⅠ酶切并去磷酸化的PUC19重组，将重组载体转入大肠杆菌DH5α中。然后将其涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，过夜培养后，经蓝白斑筛选，构建对虾部分基因组文库。采用载体质粒的通用引物进行PCR检测插入片段的大小，对基因组文库进一步进行筛选。从建立的文库中选取100个片段大小合适的克隆进行测序，其中54个克隆的DNA插入片段含有微卫星序列，共获得了111个微卫星序列，在GenBank中注册了12个微卫星序列。本实验中还发现1个含有23bp的小卫星序列。

高盐极端环境土壤基因组DNA的分离纯化方法研究及基因文库的构建

以钦州市犀牛角镇晒盐池内（盐浓度〉25％）的土壤样品为研究对象，对土壤混合基因组DNA的提取和纯化方法进行了深入研究，结果表明。冻融法、十二烷基磺酸钠（SDS）和蛋白酶K联合使用的提取法，能有效提高DNA得率，DNA的产量达到每克土壤样品10～15μg。交联聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、SeDhadex G-200树脂以及大量胶回收的使用，可有效纯化DNA。纯化的DNA产量可达每克土壤样品4～6μg，DNA片段大小〉30kb，将纯化的DNA用BamH Ⅰ部分酶切后构建以pLAFR3为载体的混合基因组文库，该文库包含15600个克隆，外源片段DNA平均大小为18kb。通过DNA序列测定和同源性比较，对从文库中随机挑取的10个克隆进行了序列分析，发现9个外源插入片段包含未知DNA序列。

灰树花总DNA的制备及基因组文库的构建

灰树花是一种珍贵的药用真菌,因为多糖含量较高,较难获得高质量的总DNA,本文提出了一种制备高质量灰树花总DNA及构建灰树花基因组文库的方法。该方法制备的灰树花总DNA,经Sau3AⅠ酶切后,用于构建基因组文库,可得到2×105个转化子/50mg,平均插入片段为14kb。为下一步克隆灰树花中的基因以及进行其他分子生物学研究奠定了基础。

碱性土壤基因组DNA的分离纯化和基因文库的构建

直接从广西南宁市凤凰纸业排污沟碱性土壤样品中抽提和分离纯化混合基因组 DNA,所获得DNA的产量为每克土壤样品 1 0～ 3 0μg。采用限制性内切酶 Eco R1酶处理后 ,构建了以 p GEM-3 Zf(+)为载体的 DNA部分文库。文库的容量为 2 3 65 0个转化子 ,外源片段 DNA平均大小为 3 .2 kb。建库效率为每克环境样品获得 60 0 0个左右的含 1～ 1 5 kb外源随机插入片段的克隆。通过 DNA序列测定和同源性比较 ,对从文库随机调取的 1 6个转化子序列进行分析 ,发现 1 3个外源插入片段包含序列尚未确定的 DNA片段。

绵羊肺炎支原体基因组DNA表达文库的构建与鉴定

为了筛选绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae,MO）免疫原性相关基因,提取MO基因组DNA,利用限制性内切酶Sau3AⅠ对基因组DNA进行酶切,回收500-3 000bp的基因组DNA片段,用T4DNA连接酶将其与经BamHⅠ酶切并去磷酸化处理的pET28a/b/c载体连接,然后转化至DH5α感受态细胞,通过菌液PCR对插入到载体中的片段大小及插入率进行鉴定。从转化的平板上提取质粒,转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,构建MO基因组表达文库。随机挑选单菌落,用pET28a/b/c通用引物进行PCR鉴定,结果显示插入片段大小为300-2 000bp,插入率为90%,表明成功构建了MO基因组表达文库,该文库的构建为进一步筛选MO相关的免疫性基因及潜在候选疫苗靶点奠定前期基础。

裴氏着色真菌基因组DNA文库的构建

为了进一步研究裴氏着色真菌基因组ＤＮＡ组成，以便为快速、准确地鉴定和诊断该菌的感染提供依据，采用Ｓａｕ３ＡＩ部分酶切基因组ＤＮＡ，以ｐＵＣ１８为载体，首次成功地构建了裴氏着色真菌基因组ＤＮＡ文库。插入片段的长度在２．５～６．０ｋｂ，ＤＮＡ文库的完整性在８４％以上。结果提示本文库大小适度、完整性较高，在实验诊断。