基因缺失鉴别ELISA试验在种猪场控制与净化猪伪狂犬病的应用

猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒（PRV）引起的一种急性、高度接触性传染病，以发热、奇痒及脑脊髓炎为主要症状。该病毒可引起各种家畜及野生动物发病，猪是该病原的传播者和自然宿主，临床表现为母猪流产、死产、产弱仔猪等繁殖障碍症状，新生仔猪发热、出现神经症状、死亡率较高。近年来，随着猪伪狂犬病疫苗特别是基因缺失疫苗的使用，猪伪狂犬病的发病率与死亡率大大减少，但目前该病仍然是威胁广西壮族自治区养猪业发展的重要疫病。2005～2006年我们应用gpI基因缺失鉴别ELISA试验对广西4个种猪场进行了猪伪狂犬病的检测，并清除带毒猪，做了控制与净化猪伪狂犬病的试验，达到了预期的净化效果。现报告如下。

鉴别猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法的建立和应用

为建立猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因缺失疫苗和野毒感染的快速鉴别诊断方法,本研究根据猪伪狂犬病野毒具有gD表面抗原基因和gE毒力基因,而基因缺失疫苗只有gD基因无gE基因的特性,针对gD/gE基因的5′端核苷酸序列自行设计引物,建立鉴别PRVgE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的检测方法对临床疑似样品进行了检测。结果表明,成功建立了鉴别PRV gE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法,该方法灵敏度高,最低检出限为100拷贝/μL;重复性好;特异性强,可特异性地扩增出PRV细胞毒中的gD和gE基因及gE基因缺失疫苗毒中的gD基因,但对PK-15细胞和猪流行性腹泻病毒等其他8种病原扩增不出任何条带;自835份临床疑似PRV感染病料中共检测出PRVgD和gE基因双阳性样品即野毒感染阳性样品267份,PRVgD基因单阳性样品28份,选取该方法检测出的26份PRV野毒感染阳性样品用于病原分离培养,两种方法的符合率为96.1%。说明本试验建立的二重PCR鉴别诊断方法快速、灵敏、特异,对于临床上疫苗毒和野毒感染的快速鉴别诊断具有重要意义。

伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株微滴数字PCR鉴别方法的建立

为建立伪狂犬病病毒(PRV)野毒株与gE基因缺失疫苗株的鉴别诊断和准确定量的微滴数字PCR(ddPCR)方法,本研究以PRV gD和gE基因为靶基因,设计并合成了2套特异性引物和Taq Man探针,建立了分别针对PRV gD和gE基因的dd PCR方法。结果显示,本研究建立的dd PCR方法能够特异性地鉴别检测PRV野毒株和疫苗株,与圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等均无交叉反应;该方法针对PRV gD、gE基因的检测限分别为3.9拷贝/μL、2.3拷贝/μL,分别比相应的荧光定量PCR (qPCR)方法敏感性高10倍和5倍;针对PRV gD、gE基因的批内和批间重复性试验结果变异系数(C.V)均小于4%;通过对45份临床样品的检测,结果显示,与病毒分离方法相比,dd PCR方法敏感性为91.7%,特异性为97.2%,符合率为97.8%;与dd PCR方法相比,q PCR的敏感性为83.3%,特异性为94.3%,符合率为95.6%。本研究建立的dd PCR方法在检测低拷贝临床样品时敏感性更高、特异性强、重复性好,可以作为PRV野毒株与疫苗株的鉴别、准确定量的有效检测手段。

伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法的建立

为实现对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)野毒株与gE基因缺失疫苗株的快速、敏感、特异的鉴别诊断,本试验针对PRVgD和gE基因设计了2套特异性引物和TaqMan探针,建立了PRV野毒株与gE基因缺失疫苗株的TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法,对引物和探针浓度、退火温度等进行了优化,对方法进行敏感性、特异性、重复性试验,并进行临床样品检测。结果显示,建立的针对gD、gE基因的TaqMan实时荧光定量PCR方法线性相关系数(R2)分别为0.996和0.980,均呈良好的线性关系;检测限分别为39.4和12.1拷贝/μL;与圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应;重复性试验结果显示,针对gD基因的批内和批间变异系数分别为1.43%~1.86%、1.10%~2.07%,针对gE基因的批内和批间变异系数分别为0.98%~1.41%、1.12%~1.86%。应用建立的TaqMan实时荧光定量PCR与普通PCR分别对11份临床疑似感染样品进行检测,阳性率分别为36.4%和27.3%。结果表明,该方法敏感性高、特异性强、重复性好,可作为伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株的早期鉴别诊断和定量检测的有效手段。

非洲猪瘟病毒流行株与基因缺失株鉴别检测规范

当前,非洲猪瘟病毒出现了基因缺失株等变异株,该类毒株的基因组序列、致病力等发生了明显变化。为了有效鉴别流行株和基因缺失株,农业农村部发布了《非洲猪瘟病毒流行株与基因缺失株鉴别检测规范》(农办牧〔2020〕39号),供业界参考。

伪狂犬病gG-ELISA鉴别诊断方法的建立及其应用

利用gG基因表达产物建立了gG-酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴别诊断方法,以该方法检测100份猪血清,结果表明该方法可显著区分gG基因缺失疫苗免疫猪和野毒感染猪,且特异性强、敏感性高。临床应用表明,该方法结果与其它临床诊断结果符合率高。以该方法在部分使用gG基因缺失疫苗的猪场做流行病学调查,共检测842份血清,检出242份阳性,阳性率为28.74%。

动物基因工程疫苗与分子鉴别诊断试剂研究进展

动物传染病是制约全球养殖业健康发展的主要因素,因而有效地预防、控制和最终消灭动物传染病是当前兽医工作者面临的重大课题和所应肩负的责任.疫苗接种尽管不是控制动物传染病发生和流行的唯一方法,但却是目前公认最有效、最实用的方法.

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR鉴别诊断方法的建立

2006年5月以来,我国部分猪场暴发了一种以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染性疾病,经病原分离及分子流行病学分析证明是由一种带有nsp2部分缺失的、对猪呈高致病性的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的。本实验参考GenBank发表的以及本实验室分离鉴定的PRRSV的nsp2基因序列,在nsp2缺失区的两端的保守区设计并合成了一对引物,建立了一种PRRSV的RT-PCR检测方法。该方法扩增高致病性PRRSV基因组时可获得230bp的片段,扩增经典型PRRSV时则获得320bp的片段,根据RT-PCR产物大小可将二者区分开来。通过大量临床病料的检测,并配合PCR产物测序验证,结果表明该方法简便、快速、特异,可以鉴别高致病性PRRSV,为进一步的PRRS流行病学研究提供了重要的技术手段。

用多重PCR鉴别猪伪狂犬病野毒与疫苗毒的研究

根据基因库中的猪伪狂犬病病毒(PRV)各基因的序列,设计了与PRV的 gB、gD、gE基因序列互补的3对引物。对样品中的PRV DNA模板进行了多重PCR扩增及反应条件的优化,结果同时得到与设计相符合的3条特异性条带,分别为549 bp(gB)、429 bp(gD)、366 bp(gE)。用这3对引物对三基因缺失疫苗毒的样品DNA模板进行多次多重 PCR扩增,均能稳定得到与设计相符合的2条特异性条带。敏感性试验结果表明,多重 PCR可以检测到 106 pg三基因缺失疫苗毒或756 pg PRV野毒的核酸模板量。特异性试验结果表明,以正常对照细胞及猪圆环病毒和猪细小病毒DNA为模板进行多重PCR扩增,均无任何条带。

新疆某种猪场猪瘟、猪伪狂犬病的净化与维持

猪伪狂犬病病毒(PRV)g E基因缺失疫苗的推广使用,与之配套的商品化的g E抗体ELISA检测试剂盒可以准确区分疫苗免疫和野毒感染,成为当前有效控制和净化猪伪狂犬病的主要策略。欧美许多国家根据该策略根除了PRV野毒,我国部分种猪场也因此实现了PRV的净化。

鉴别检测野生株和基因缺失株非洲猪瘟病毒多重荧光定量PCR方法的建立

为建立一种鉴别检测野生型和基因缺失株非洲猪瘟病毒(ASFV)的方法,本研究根据GenBank中登录的ASFV P72、CD2v、MGF360-14L基因保守序列设计引物和探针,通过方阵法优化体系后,建立了一种可以同时检测P72、CD2v、MGF360-14L基因的多重荧光定量PCR方法。该方法与伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均无交叉反应,可鉴别野生型和基因缺失株ASFV,特异性强;敏感性试验结果显示,该方法对P72、CD2v和MGF360-14L重组质粒标准品的最低检测限均为100 copies/m L,敏感性高;组内和组间变异系数均小于2%,表明该方法重复性较好。利用ASFV核酸检测试剂盒与本实验室建立的方法分别对35份临床样品进行检测,两种方法的检出率均为68.57%,阳性符合率为100%。上述结果表明,本研究建立的多重荧光定量PCR方法对ASFV的鉴别检测、病原流行病学调查等研究具有重要意义。

鉴别检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失疫苗株的三重荧光PCR的建立

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African swine fever,ASFV)引起的猪的一种急性、高度接触性传染病。本研究根据ASFV B646L、MGF360⁃14L和CD2v基因设计了3套引物和探针,建立了可同时鉴别检测ASFV野毒株和基因缺失疫苗株的三重荧光PCR方法。结果表明,该法特异性强,可同时检测ASFV B646L、MGF360⁃14L和CD2v基因,与猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、猪A型塞内卡病毒等无交叉反应;两份ASFV MGF360⁃505R与CD2v基因联合缺失疫苗株DNA三重荧光PCR法检测结果都仅出现一条B646L扩增曲线,与预期一致;灵敏度高,该法对重组质粒pUC⁃B646L、pUC⁃360⁃14L和pUC⁃CD2v的检出限分别为1.572×10^(3)拷贝/mL、1.934×10^(3)拷贝/mL和1.929×10^(3)拷贝/mL,灵敏度比世界动物卫生组织(World organization for animal health,OIE)推荐的荧光PCR高10倍;重复性好,对三种重组质粒检测的Ct值批内和批间变异系数均小于2%;应用该法及OIE推荐的荧光PCR对1215份样品进行平行检测,结果显示23份样品为阳性,1192份样品为阴性,两种方法检测结果一致。本研究建立的方法能鉴别检测ASFV野毒株和基因缺失疫苗株(缺失MGF360⁃505R和/或CD2v基因),对将来基因缺失疫苗的推广应用及ASF疫情防控具有重要的意义。

伪狂犬病强弱毒鉴别诊断试剂盒研制成功

目前,国际上普遍应用的伪狂犬病弱毒疫苗是gE基因缺失疫苗。在我国广泛应用的也是此苗。目前存在的主要问题是,注苗猪与强毒感染猪不易区分等。为此。

蓝耳病鉴别诊断试剂盒研制成功

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS，俗称蓝耳病）是影响养殖业的首要传染病。过去因PRRS弱毒疫苗散毒、致病力返强及疫苗毒本身有很强的免疫抑制性等原因，使该病的防控束手无策。中国农业科学院特产研究所研制的高致病性蓝耳病基因缺失疫苗（TJM株）彻底改变了这一现状。

蓝耳病鉴别诊断试剂盒研制成功

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS，俗称蓝耳病）是影响养殖业的首要传染病。过去因PRRS弱毒疫苗散毒、致病力返强及疫苗毒本身有很强的免疫抑制性等原因，对该病的防控束手无策。中国农业科学院特产研究所研制的高致病性蓝耳病基因缺失疫苗（TJM株）彻底改变了这一现状。

蓝耳病鉴别诊断试剂盒研制成功

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS，俗称盈耳病）是影响养殖业的首要传染病。过去因PRRS弱毒疫苗散毒、致病力返强及疫苗毒本身有很强的免疫抑制性等原因．使该病的防控束手无策。中国农业科学院特产研究所研制的高致病性蓝耳病基因缺失疫苗（TIM株）彻底改变了这一现状。为了在猪群中有效地区别接种疫苗和受野毒感染的猪，华威特生物科技有限公司于日前研发成功了首个可鉴别诊断高致病性PRRS野毒和疫苗株（TIM）RT-PCR-步法试剂盒，能快速确诊蓝耳病野毒感染，为蓝耳病疫情监测、优化防疫方案及蓝耳病毒的净化提供了关键技术手段。

蓝耳病鉴别诊断试剂盒研制成功

本刊辑：据中国畜牧兽医报2011年5月26日报道．猪繁殖与呼吸综合征（PRRS，俗称蓝耳病）是影响养殖业的首要传染病。过去因蓝耳病弱毒疫苗散毒、毒力返强及疫苗毒本身有很强的免疫抑制性等原因，使该病的防控束手无策。中国农业科学院特产研究所研制的高致病性蓝耳病基因缺失疫苗（TJM株）彻底改变了这一现状。

广西猪伪狂犬病毒感染状况调查报告

为了解广西猪伪狂犬病毒的感染状况,应用PCR技术对来自广西46个种猪场的1940份公猪精液进行了猪伪狂犬病毒(PRV)的检测,阳性率为0;同时对广西25个已使用猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗猪场的1455份送检血清,采用了猪伪狂犬病基因缺失鉴别ELISA方法进行了血清学抗体监测,结果检出猪伪狂犬gE抗体阳性11份,阳性率为0.76%。结果表明,广西猪群中存在猪伪狂犬病野毒感染,但感染率较低。

闽西地区猪伪狂犬野毒株感染的血清学调查

美国IDEXX公司生产的PRV-gE（gE-ELISA）酶联免疫试剂盒,能对已免疫PR缺失gE的基因工程疫苗或未免疫的猪群,区分疫苗株和野毒株感染。2005～2007上半年,对闽西地区使用gE-基因缺失疫苗的规模化猪场母猪、仔猪和生长猪,不分健康状况,进行PR野毒株感染的血清学调查,结果显示2005年至2006年上半年,该地区母猪PR野毒感染阳性率较高,达41.5%和43.8%,2006年下半年至2007上半年,该地区母猪PR野毒感染阳性率有较大幅度的降低,且阴性猪场很多,阳性率分别是21.3%和13.3%。同时3年来对54个规模化猪场监测结果分析,各猪场阳性率差异很大,3年来猪场阳性率也呈大幅度下降,2007年上半年猪场阳性率仅为33.3%。对仔猪和生长猪的监测结果显示,阳性率比母猪大大降低,并且也呈下降的趋势。

规模猪场伪狂犬病净化的机遇和挑战

伪狂犬病严重危害全球养猪业健康发展，我国也不例外。一些发达国家通过免疫基因缺失苗和实施鉴别诊断，及时淘汰带毒猪，已成功在家猪中净化了伪狂犬病。本文对伪狂犬病毒的主要流行病学特征、规模猪场伪狂犬病流行概况、伪狂犬病净化的机遇和挑战进行了详细综述，并提出了相关防控净化建议。