维吾尔族妇女宫颈癌及癌前病变组织中EGR1和ID4基因表达下调与HPV感染的关系

目的：探讨宫颈癌及癌前病变组织中基因下调表达调控与人乳头状瘤病毒（human papillomavirus， HPV）感染的依存关系，为建立 HPV 筛查预警的宫颈癌辅助诊断指标提供依据。方法收集维吾尔族妇女宫颈鳞癌（cervical squamous cell carcinoma，CSCC）、宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）Ⅱ～Ⅲ及宫颈炎患者的新鲜宫颈上皮组织标本共100例，提取组织 DNA 和 RNA，鉴定 HPV 阳性和型别，选择 HPV 阳性CSCC 和 CINⅡ～Ⅲ及 HPV 阴性宫颈炎组织 RNA，利用荧光定量 RT-PCR 方法鉴定早期生长反应基因-1（EGR1）、DNA 结合抑制因子4（ID4）、FBJ 鼠科骨肉瘤病毒原癌基因（FOS）和早期应急蛋白2（IER2）基因的转录表达水平。结果通过 HPV 阳性鉴定和分型，鉴别出 HPV16、18、45、31等8种 HPV 感染型别，宫颈癌、CIN 和宫颈炎组织的 HPV 阳性率分别为94．4％、75．0％和31．3％，其中 HPV16阳性率为66．6％、68．7％和31．3％；HPV 阳性的 CSCC 组织中 EGR1、ID4、FOS 和 IER2基因的 mRNA 表达水平低于 HPV 阳性的 CIN 和 HPV 阴性宫颈炎，且 CSCC 与 CIN 或 NC 比较差异均有统计学意义（P ＜0．05），而 HPV 阳性的 CIN 组织中4种基因的表达水平均低于 HPV 阴性的宫颈炎组织，两者 EGR1和 ID4基因表达水平差异有统计学意义（P ＜0．05）；从 HPV16感染的角度分析，CSCC 或 CIN 与宫颈炎 EGR1和 ID4表达水平差异有统计学意义（P ＜0．05），但是 CSCC 与 CIN 相比较，只有 EGR1基因表达水平差异有统计学意义（P ＜0．05），而 ID4基因差异无统计学意义（P ＞0．05）。结论宫颈癌及癌前病变与依赖于 HPV 感染的 EGR1和 ID4基因表达下调有关，其中 EGR1基因表达水平变化可能与癌前病变和 HPV16感染的关系更为密切，可能成为 HPV 筛查预警的宫颈癌辅助诊断指标，并为揭示 HPV感染的致病和致癌分子机制提供了重要依据。

神经元表达下调基因9在人脑胶质瘤中的表达

目的探讨神经元表达下调基因9(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated,NEDD9)在人脑胶质瘤组织中的表达情况。方法采集人脑胶质瘤术中切除组织标本36例作为试验组(低级别胶质瘤组14例,高级别胶质瘤组22例),重型颅脑损伤内减压切除的正常脑组织10例作为对照组。采用逆转录聚合酶链反应法测定NEDD9 mRNA的转录水平,同时采用免疫组织化学SP法检测人脑胶质瘤组织中NEDD9蛋白的表达情况。结果 NEDD9蛋白阳性表达率在正常脑组织、低级别胶质瘤、高级别胶质瘤中呈明显上升趋势,低级别胶质瘤组和高级别胶质瘤组NEDD9蛋白阳性表达率明显高于对照组(P<0.05)。低级别胶质瘤组和高级别胶质瘤组NEDD9 mRNA表达量明显高于对照组,高级别胶质瘤组NEDD9 mRNA表达量明显高于低级别胶质瘤组(P<0.05)。结论 NEDD9在神经胶质瘤中的转录和蛋白表达水平显著增高,且表达率及表达水平随肿瘤恶性程度的加重而增高。

MicroRNA-218靶向神经元表达发育下调基因9对胃癌细胞增殖和侵袭的影响

目的观察microRNA-218(miR-218)对胃癌细胞SGC-7901增殖和侵袭的影响,并探讨其作用机制。方法体外培养人胃癌细胞SGC-7901,将对数生长期细胞分为空白对照组、阴性对照组和miR-218 mimics组,阴性对照组和miR-218 mimics组细胞分别转染阴性对照序列和miR-218 mimics,空白对照组细胞不进行转染。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测3组细胞中miR-218表达,细胞计数试剂盒-8检测3组细胞培养24、48、72、96 h时的增殖活性;平板细胞克隆形成实验检测3组细胞克隆能力;Transwell实验检测3组细胞侵袭能力;Western blot法检测3组细胞中神经元表达发育下调基因9(NEDD9)蛋白、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、神经型钙黏附蛋白(N-cadherin)的表达。将SGC-7901细胞分为阴性对照组+NEDD93′非编码区(3′UTR)-Wt组(阴性对照序列、pCHECK2-NEDD93′UTR-Wt共转入SGC-7901细胞)、miR-218 mimics+NEDD93′UTR-Wt组(miR-218 mimics、pCHECK2-NEDD93′UTR-Wt共转入SGC-7901细胞)、阴性对照组+NEDD93′UTR-Mut组(阴性对照序列、pCHECK2-NEDD93′UTR-Mut共转入SGC-7901细胞)、miR-218 mimics+NEDD93′UTR-Mut组(miR-218 mimics、pCHECK2-NEDD93′UTR-Mut共转入SGC-7901细胞),常规培养48 h后收集各组细胞,采用发光检测仪测定各组细胞中荧光素酶活性,分析miR-218与NEDD9的靶向关系。结果与空白对照组和阴性对照组比较,miR-218 mimics组细胞中miR-218表达及培养24、48、72、96 h时细胞增殖抑制率显著升高(P<0.05),NEDD9蛋白表达及细胞克隆形成数量和侵袭细胞数量显著减少(P<0.05);空白对照组与阴性对照组细胞中以上各指标比较差异均无统计学意义(P>0.05)。miR-218 mimics+NEDD93′UTR-Wt组细胞中荧光素酶活性显著低于阴性对照组+NEDD93′UTR-Wt组、阴性对照组+NEDD93′UTR-Mut组和miR-218 mimics+NEDD93′UTR-Mut组(P<0.05)。与空白对照组和阴性对照组比较,miR-218 mimics组细胞中E-cadherin蛋白表达显著升高,vimentin、N-cadherin蛋白表达显著降低(P<0.05)。空白对照组与阴性对照组细胞中E-cadherin、vimentin、N-cadherin蛋白表达比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论miR-218过表达胃癌细胞SGC-7901中NEDD9蛋白表达显著下调,microRNA-218可能通过靶向下调NEDD9表达而抑制SGC-7901细胞的增殖及侵袭能力。

紫云英根瘤中共生固氮下调表达基因的分离与初步分析

对前期利用抑制消减杂交技术（Suppressive subtractive hybridization， SSH）构建的紫云英（A stra-galus sinicus）根部组织的共生固氮差异表达cDNA文库进行了全文库测序和初步分析，并利用半定量RT-PCR方法验证了其中5个基因片段在根瘤中的下调表达。结果表明，从180个克隆中共获得94个有效序列，文库插入片段长度为200~1300 bp。 BLAST同源比对分析结果表明，有90个序列可以找到同源片段，有4个可能为新基因，按功能分为10个类群。

CRISPR-Cas13a系统在斑马鱼基因表达下调中的应用研究

该研究建立了基于CRISPR-Cas13a系统的斑马鱼基因表达下调体系,并对其效果和特异性进行了检测分析。以斑马鱼报告基因egfp和内源性基因ta、fabp11a为研究对象,设计并合成靶向靶标基因的crRNA及其突变体,构建Cas13a及其突变体(dCas13a)的表达质粒,在体外合成Cas13a-mRNA和dCas13a-mRNA(dCas13a),分别与各crRNA共注射至野生型AB和egfp转基因斑马鱼胚胎中,通过表型观察及qRT-PCR技术验证靶标基因表达下调的情况。结果表明,Cas13a-mRNA分别与egfp-crRNA、ta-crRNA和fabp11a-crRNA共注射后,可相应导致斑马鱼体内绿色荧光蛋白减少、尾部发育缺陷以及眼睛发育缺陷等表型;qRT-PCR结果显示,注射Cas13a-mRNA和各靶基因crRNA后egfp、ta和fabp11a表达均下调;而用含有序列突变的Cas13a或者crRNA注射后,CRISPR-Cas13a系统无法下调靶基因表达。该研究表明CRISPR-Cas13a系统可有效下调斑马鱼体内基因的表达。

心肌成纤维细胞在血管紧张素Ⅱ刺激下表达下调基因的分离和鉴定

目的:对成年大鼠心肌成纤维细胞(CF)受血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激后下调基因表达谱进行筛选及分析。方法:以受AngⅡ刺激CF为驱动方,未刺激CF为实验方,进行抑制消减杂交(SSH)建立消减cDNA文库。经斑点杂交筛选文库后将部分阳性克隆测序及进行同源性分析。结果:共获得17条下调表达基因,分别与胞内信号转导、转录抑制、纤维沉积和细胞骨架重构相关,并克隆到4条新基因表达序列标签(EST)。结论:SSH有效地克隆了成年大鼠CF受AngⅡ刺激后下调表达基因,对这些基因的研究将有助于阐明心肌改建的分子机制。

神经元表达发育下调基因siRNA表达载体的构建及鉴定

目的:构建针对神经元表达发育下调基因9(Neural precursor cell expressed,developmentally downregulated 9,NEDD9)的小干扰RNA(siRNA)表达载体,研究载体介导的RNAi技术对A549肺腺癌细胞株中NEDD9表达的抑制作用。方法:根据GenBank提供的NEDD9基因(NM_182966)核苷酸序列及siRNA的设计原则,筛选得到159-177 nt、193-211 nt和648-666 nt 3个19 bp片段靶序列,同时随机组合出一条无关序列;分别合成4对带有BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的发夹结构寡核苷酸序列,经退火合成互补DNA双链,克隆入载体pRNAT-CMV3.2中构建重组表达载体,转化DH5α,提取质粒,应用PCR技术和测序方法鉴定重组克隆。用脂质体介导转染入A549肺腺癌细胞株,采用QRT-PCR和Western blot方法检测细胞NEDD9基因mRNA和蛋白表达。结果:PCR筛选得到4个目的片段的阳性克隆,测序证实重组表达载体中插入序列与设计一致。RTPCR和Western blot检测显示构建的siRNA表达载体可显著降低A549细胞中NEDD9 mRNA和蛋白水平的表达。结论:成功构建载体介导的NEDD9靶向RNA干扰重组体,并能有效抑制A549细胞中NEDD9基因的表达。

宫颈癌及癌前病变的全基因组表达谱分析及下调表达候选基因鉴定

目的探讨维吾尔族妇女宫颈癌组织特异的下调表达基因谱,建立基于下调表达基因的宫颈癌早期诊断方法。方法收集维吾尔族妇女宫颈病变新鲜组织标本72例,其中宫颈鳞癌(cervical squamous cell carcino-ma,CSCC)25例,宫颈内上皮瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)22例,正常宫颈组织(normal cervix,NC)25例。选择20例组织标本(CSCC 7例,CINⅢ6例,NC 7例),提取组织RNA,通过人类全基因组表达谱芯片及生物信息分析,筛选宫颈癌及癌前病变(CIN)特异性下调表达候选基因。通过对CSCC与正常对照(NC)组的基因差异表达谱进行比较分析,选取10种差异表达倍数较高的候选基因,利用72例宫颈病变组织RNA,对10种下调表达候选基因的表达水平进行半定量RT-PCR鉴定,确定宫颈癌及癌前病变与该基因表达水平变化的关系。结果以2倍及以上表达差异为量化标准,有下调表达候选基因112种。72例宫颈病变组织RNA的半定量RT-PCR筛查分析,发现在CSCC与正常对照组之间,FOSB、DNASE1L3、SCARA5、EGR1、ABI3BP、FOS、KLF4、RHOB、IER2和ID4等10种下调表达基因的差异均有统计学意义(P<0.05)。DNASE1L3、EGR1、FOS、KLF4和IER2等5种基因的表达水平差异在CIN与正常对照组之间有统计学意义(P<0.05),但是除了FOS基因外,其余4种基因表达在CSCC与CIN组之间无差异(P>0.05)。结论维吾尔族妇女宫颈癌发病进程可能与一系列基因的下调表达密切相关,而DNASE1L3、EGR1、FOS、KLF4和IER2等5种基因的表达水平变化可能成为宫颈癌早期预警指标。

NEDD9、FAK在上皮性卵巢癌中的表达及临床意义

目的:探讨神经元细胞表达的发育下调基因9(neural precursor cell-expressed developmentally down-regulated 9,NEDD9)及黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)在上皮性卵巢癌中的表达及临床意义。方法:采用免疫组化法检测NEDD9及FAK在52例上皮性卵巢癌、13例卵巢交界性肿瘤、28例卵巢良性肿瘤及17例正常卵巢组织中的表达,并对二者在卵巢癌组织中的表达做相关性分析。结果:NEDD9在上皮性卵巢癌组织中的表达明显高于卵巢交界性肿瘤(P=0.000)、卵巢良性肿瘤(P=0.000)及正常卵巢组织(P=0.000),差异有统计学意义。FAK在上皮性卵巢癌组织中的表达明显高于卵巢交界性肿瘤(P=0.002)、卵巢良性肿瘤(P=0.000)及正常卵巢组织(P=0.000),差异有统计学意义。NEDD9的表达在卵巢癌的FIGO分期(P=0.000)、组织分化程度各亚组间有统计学差异(P=0.010),而在确诊时年龄(P=0.756)、血清CA-125水平(P=0.300)、病理类型(P=0.526)及腹水(P=0.506)各亚组间无统计学差异;FAK的表达在FIGO分期(P=0.008)及腹水(P=0.027)亚组间有统计学差异,而在确诊时年龄(P=0.299),血清CA-125水平(P=0.116)、组织分化程度(P=0.100)及病理类型(P=1.000)各亚组间无统计学差异。NEDD9和FAK在卵巢癌中的表达成正相关(r=0.535,P<0.05)。结论:NEDD9及FAK在上皮性卵巢癌中高表达,早期联合检测NEDD9和FAK可能对判断上皮性卵巢癌恶性程度有重要的临床意义。

NEDD9表达变化与神经胶质瘤的恶性表型及不良预后的关系

目的:探讨NEDD9表达变化与神经胶质瘤的恶性表型及不良预后的关系。方法:选择神经胶质瘤患者100例,根据恶性程度分为低度恶性组(Ⅰ~Ⅱ级胶质瘤)和高度恶性组(Ⅲ~Ⅳ级胶质瘤),每组各50例。同时收集重度颅脑外伤患者50例作为对照组。采用免疫组化法检测NEDD9在各组脑组织中的表达情况;采用qRT-PCR和Western blot法检测各组脑组织中NEDD9 mRNA和蛋白表达情况,随访5年观察术后两组胶质瘤患者预后情况,分析NEDD9蛋白表达与预后的关系。结果:免疫组织化学染色实验结果显示,在对照组的脑组织中NED9蛋白的表达极低,在低度恶性组和高度恶性组中NEDD9表达较高,且高度恶性组明显高于低度恶性组(P<0.05);胶质瘤患者脑组织中NEDD9 mRNA及蛋白相对表达量均高于对照组(P<0.05);术后NEDD9蛋白低表达组生存率明显高于NEDD9蛋白高表达组(P<0.05);多因素COX回归分析显示,NEDD9蛋白高表达是神经胶质瘤患者生存期缩短的独立危险因素。结论:NEDD9表达与神经胶质瘤的恶性表型关系密切,与神经胶质瘤恶性进展有关,是患者一个独立的预后危险因素。

大鼠耳蜗组织中Nedd4及SGK1的表达

目的研究大鼠耳蜗组织中神经前体细胞表达-发育性下调基因亚型(neural precursor cell-ex-pressed,developmentally downregulated isoforms,Nedd4)及血清糖皮质激素诱导激酶1(serum glucocorticoid-in-ducible kinase1,SGK1)蛋白分子的表达。方法选取健康Wistar大鼠8只,用特异性多克隆兔抗鼠Nedd4-1/2、Nedd4-2及SGK1抗体,采用免疫组化法研究大鼠耳蜗组织中Nedd4-1/2、Nedd4-2及SGK1蛋白的表达模式。结果Nedd4-1/2、Nedd4-2及SGK1蛋白广泛表达于大鼠耳蜗组织的各个区域中,包括血管纹、螺旋韧带、Corti器、螺旋缘、螺旋神经节、前庭膜等处。结论在耳蜗组织中,存在一个由SGK1、Nedd4和上皮钠通道(ENaC)组成的Na+转运系统,它们协同作用转运Na+,从而保持内耳内环境的稳定。

老年垂体瘤患者垂体组织NEDD4-1 mRNA PTEN蛋白的表达及其相关性

目的 探讨老年垂体瘤患者垂体组织中神经前体细胞表达发育进行性下调基因4-1 mRNA、第10号染色体丢失的磷酸酶张力蛋白同源物基因蛋白的表达及其相关性.方法 将手术切除的42例垂体瘤新鲜标本中,22例侵袭性垂体瘤组织设为A组,20例非侵袭性垂体瘤组织设为B组,另将23例正常垂体组织设为对照组,比较3组神经前体细胞表达发育进行性下调基因4-1 mRNA、磷酸酶张力蛋白同源物基因蛋白的水平及阳性率,并进行相关性分析.结果 调基因4-1 mRNA、磷酸酶张力蛋白同源物基因蛋白的水平及阳性率,并进行相关性分析.结果A组神经前体细胞表达发育进行性下调基因4-1 mRNA水平及阳性率显著高于B组、对照组(P<0.05),磷酸酶张力蛋白同源物基因蛋白水平及阳性率显著低于B组、对照组(P<0.05).相关分析显示,神经前体细胞表达发育进行性下调基因4-1 mRNA水平与磷酸酶张力蛋白同源物基因蛋白水平呈显著负相关(P<0.05).结论 神经前体细胞表达发育进行性下调基因4-1mRNA、磷酸酶张力蛋白同源物基因蛋白在老年垂体瘤患者组织中均有表达,且二者呈负相关.

胃癌组织中NEDD4L的表达及其临床意义

目的研究胃癌中神经前体细胞表达发育下调样基因4(NEDD4L)的表达及其临床意义。方法分别采用实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法检测25对胃癌组织及其对应癌旁正常胃组织中NEDD4L的mRNA和蛋白表达水平,采用免疫组化方法(IHC)检测NEDD4L在124例胃癌组织和25例癌旁正常胃组织中的表达情况,并统计分析其表达与胃癌患者临床病理参数及预后之间的关系。结果NEDD4L在胃癌组织中的mRNA和蛋白表达水平均显著低于对应癌旁正常组织(P <0. 05)。免疫组化结果显示NEDD4L在胃癌组织中的阳性表达率明显低于癌旁正常组织(P <0. 05)。NEDD4L的表达与肿瘤组织分化程度(P <0. 05)、浸润深度(P <0. 05)和临床TNM分期(P <0. 05)显著相关,且NEDD4L高表达的胃癌患者其预后较好(P <0. 001)。结论 NEDD4L在胃癌组织中低表达,可能与胃癌的发生发展密切相关,且可能作为判断胃癌预后的潜在指标。

鲨肝再生过程中下调表达基因NT7. 1的克隆表达及分离纯化(英文)

构建了鲨鱼肝再生过程中下调表达基因NT7 .1的原核表达载体pET-NT7 .1 ,转化大肠杆菌BL21后,IPTG诱导获得了其原核融合表达产物;利用Hisobind kits对表达产物进行了分离纯化。结果显示,在终浓度0 .01 mmol/L的IPTG的诱导下,NT7 .1编码的蛋白nt7 .1在大肠杆菌中高效表达,目的蛋白占菌体总蛋白的41 %,表达产物的相对分子质量大小约为18 000 ,与预期的相对分子质量大小相当。对于nt7 .1的相关研究尤其活性研究仍在进行中,上述工作为研究该未知基因的功能奠定了基础。

NEDD9基因miRNA干扰质粒的构建及鉴定

目的构建神经元表达发育下调基因9(NEDD9)特异性微小核糖核酸(miRNA)干扰质粒,检测其在胃癌SGC-7901细胞中的干扰效果。方法根据GenBank中提供的NEDD9基因序列,设计4种NEDD9靶向干扰序列(MR0112-1、MR0112-2、MR0112-3和MR0112-4)及1种阴性对照干扰序列(MR0112-N),连接到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体中,构建重组质粒。重组质粒转染人胃癌细胞株SGC-7901;采用FQ-PCR和Western blot法检测转染前后SGC-7901细胞中NEDD9mRNA及蛋白的表达。结果测序表明,4种干扰质粒的干扰序列及读框完全正确。FQ-PCR和Western blot结果显示,转染MR0112-1、MR0112-2、MR0112-3和MR0112-4质粒后其NEDD9表达较未处理组分别下降88.01%、96.70%、78.55%和81.34%(P<0.05),以MR0112-2干扰效果最为明显。阴性质粒组NEDD9mRNA表达与未处理组比较无明显变化(P>0.05)。结论成功构建了NEDD9干扰质粒,为进一步研究NEDD9基因表达在胃癌增殖、迁移、侵袭过程中的作用提供实验基础。