APC11基因真核表达质粒构建及鉴定

目的克隆扩增APC11开放阅读框基因片段，构建其真核表达重组质粒，为后续研究其功能做准备。方法按照GenBank中人APC11序列设计引物，以HeLa细胞cDNA为模板，扩增出基因片段。该片段与真核表达载体pEGFP-C1连接，得到的重组质粒经双酶切和测序鉴定后用Western印迹检验表达。结果扩增片段长度为285bp，重组真核表达质粒经双酶切鉴定后测序鉴定正确。Western印迹证实pEGFP—C1-APC11在真核细胞内表达。结论成功克隆了APC11基因并构建了pEGFP—C1-APC11真核表达重组质粒，Western印迹证实其表达良好，对该基因功能的深入研究打下了坚实基础。

重组泛素连接酶PTB-U-box/RING的构建与表达

目的 构建重组泛素连接酶PTB-U-box、PTB-RING,并克隆进入pFLAG-CMV4真核表达载体,为研究靶向降解受体型酪氨酸激酶IGF-IR,抑制肿瘤细胞生长提供基础.方法 分别设计引物,扩增接头分子IRS-1的PTB结构域以及E3泛素连接酶CHIP的U-box、Cbl的RING结构域,再利用重组PCR,将PTB分别与U-box、RING进行融合,双酶切之后将其插入真核表达载体pFLAG-CMV4,经过酶切鉴定及测序后,转染HeLa细胞,Western 印迹验证重组质粒的表达.结果 PCR结果显示PTB-U-box条带大小840 bp,PTB-RING大小为620 bp,重组质粒经酶切鉴定和测序结果正确,转染后可见融合蛋白的表达.结论 成功构建真核重组表达载体pFLAG-CMV4-PTB-U-box和 pFLAG-CMV4-PTB-RING,并且转染HeLa细胞后证实其能够正确表达.

Akt1与凋亡诱导因子AIF相互作用的研究

目的确定Akt1与凋亡诱导因子AIF是否存在相互作用及其可能的作用方式。方法从成人肝cDNA文库中扩增获得Akt1和AIF基因,构建融合Flag标签的Akt1(pFlag-Akt1)和融合Myc标签的AIF(pMyc-AIF)真核表达重组质粒,转染细胞后通过免疫共沉淀反应,检测二者在体内的结合情况;构建融合GST标签的AIF原核表达重组质粒,诱导表达并纯化后获得融合蛋白GST-AIF,通过GST-pulldown实验检测GST-AIF与融合Flag标签的Akt1蛋白在体外的结合情况;构建融合GFP标签的AIF的真核表达重组质粒,转染细胞,观察在凋亡信号刺激下AIF的转位情况,及Akt1的活化对该过程的影响。结果Akt1可与AIF在细胞内、外结合,且活化的Akt1对AIF在凋亡信号刺激下的核转位具有抑制作用。结论活化的Akt1可能通过抑制AIF在凋亡信号刺激下的核转位过程而发挥其抗凋亡活性。