LRRC4基因表达能降低胶质母细胞瘤细胞系U251的生长和成瘤潜能(英文)

背景与目的:LRRC4是作者最近克隆的一个新基因,该基因在原发性脑肿瘤活检标本中明显表达下调。本研究旨在研究LRRC4基因是否具有抑制脑肿瘤生长的能力。方法:LRRC4基因的全长编码区被亚克隆至表达载体pcDNA3.1中,应用脂质体转染的方法将重组的质粒载体导入胶质母细胞瘤细胞系U251,经G418筛选,建立稳定表达LRRC4基因的U251的细胞系。采用细胞增殖实验、软琼脂实验、肿瘤形成实验来考察LRRC4基因表达对于细胞生长和肿瘤形成的影响。结果:经过脂质体转染和筛选,建立了稳定表达LRRC4全长编码区的U251细胞系,用于进一步实验。比较未转染组和转染空白载体组,Northernblot实验证实转染了LRRC4基因的细胞LRRC4mRNA的表达增强。细胞增殖一定时间后,转染LRRC4基因的细胞较未转染细胞的生长速度明显减慢,克隆形成率明显降低。将这些细胞注射入无胸腺裸鼠体内,40天后处死裸鼠,测量肿瘤大小,结果显示转染LRRC4基因的细胞形成的肿瘤明显小于对照组。结论LRRC4基因可转染于人脑胶质母细胞瘤细胞系U251。LRRC4在U251细胞的表达有抑制瘤细胞增殖和抑制裸鼠移植瘤的形成和生长的作用。

非病毒载体介导的人凝血因子Ⅷ基因在小鼠32D细胞系中的表达

为了观察非病毒载体 pRC/RSV介导的人凝血因子Ⅷ基因在小鼠 32D细胞系中的表达 ,将B结构域缺失(△ 76 0aa - 16 39aa)的人FⅧcDNA(hFⅧBDcDNA)亚克隆至质粒载体pRC/RSV ,构建重组质粒载体 pRC/RSV hFⅧBDcDNA。经SuperFectTransfectionReagent转染小鼠 32D细胞系 ,分别采用一期法、ELISA法和RT PCR检测细胞培养上清液中人FⅧ的促凝活性 (hFⅧ∶C)和抗原含量 (hFⅧ∶Ag)以及细胞中hFⅧBDcDNA的转录。结果表明 :小鼠 32D细胞系培养上清液中的人FⅧ∶Ag最高达到了 4 5 0 .0 8毫微克 /(10 6细胞·2 4小时 ) ,hFⅧ∶C最高达到了 2 .0 1单位 /(10 6细胞·2 4小时 ) ,RT PCR可检测到 32D细胞中hFⅧBDcDNA转录的mRNA。结论 :非病毒质粒载体 pRC/RSV介导的人凝血因子Ⅷ基因能够在小鼠 32D细胞系中表达人FⅧ蛋白 ,所表达的FⅧ与正常人血浆中的野生型FⅧ具有相似的凝血活性。

HCAP1两种基因型对肝癌细胞系Hep3B基因表达的影响

背景与目的:HCAP1(HCC-associatedprotein1)基因是我们室克隆的一个新基因,HCAP1基因有N和M两种基因型,本研究旨在探讨HCAP1N和HCAP1M基因型对肝癌细胞基因表达的影响。方法:用脂质体转染试剂,将HCAP1M与HCAP1N分别转染Hep3B-Tet-on肝细胞性肝癌细胞株;为了获得高诱导表达HCAP1N或HCAP1M的细胞株,通过Westernblot方法筛选被转染的细胞。然后,通过人cDNAarray膜片杂交技术分析HCAP1N或HCAP1M诱导表达前后的细胞基因表达谱。杂交结果用复日Smartview2001图像分析软件进行分析比较。结果:建立了HCAP1N和HCAP1M过表达前后的差异基因表达谱。结果表明HCAP1M过表达引起参与细胞增殖的基因表达上调(如c-erbB2受体和转录因子DP2),以及起凋亡作用基因(caspase9)及DNA切割修复蛋白基因(ERCC5)的表达下调;而HCAP1N过表达引起抑制细胞生长基因(如snoN和WAF1)和DNA切割修复蛋白基因(ERCC5)的表达上调,以及抗凋亡基因(HSPs)的表达下调。结论:HCAP1M基因过表达可能促进细胞过度增殖,HCAP1N过表达可能抑制细胞生长。

建立cDNA微矩阵基因芯片技术并分析食管癌细胞系Eca109基因表达谱

为筛选食管癌相关基因,建立并应用cDNA微矩阵技术分析了食管癌细胞系ECa109基因表达谱。结果显示,在886条基因中,ECa109细胞系与正常食管上皮细胞间存在显著差异表达的基因有107条(12.08%),其中表达上调的51条(5.76%),表达下调的56条(6.32%)。定量RT-PCR验证其中2个基因的表达水平,结果一致。建立T7 RNA聚合酶扩增技术,并对比分析了无扩增样品的基因表达谱,两者表现了较好的吻合性,这为cD-NA微阵技术分析原发性食管癌微量肿瘤细胞的基因差异表达谱提供了方法学。食管癌细胞株ECa109基因表达谱的分析也使我们对食管癌病变机制有了一个初步的了解。

建立高表达小鼠Retn基因的3T3-L1细胞系的研究

目的:建立一个组成性地高表达小鼠Retn基因的3T3-L1细胞系。方法:(1)采用重组DNA技术将小鼠Retn基因的全长cDNA克隆到质粒pcDNA3的CMV启动子下面而获得一个能在真核细胞内组成性表达小鼠Resistin蛋白的表达载体pcDNA3-mRetn。(2)用电穿孔转染和G418筛选等方法建立能组成性地高表达小鼠Retn基因的3T3-L1细胞系。(3)诱导细胞分化为脂肪细胞,并用实时荧光RT-PCR法分析这些脂肪细胞内Retn基因mRNA的水平。结果:构建了一个能在真核细胞内表达小鼠Retn基因的表达载体;建立了一个携带有pcDNA3-mRetn载体并组成性地高表达小鼠Retn基因的细胞系。结论:成功地建立了一个组成性地高表达小鼠Retn基因细胞系,为进一步研究Retn基因的功能和小鼠Resistin蛋白的获得奠定了基础。

口腔颌面部肿瘤细胞系中PTEN抑癌基因蛋白表达的研究

目的:研究口腔颌面部恶性肿瘤细胞系内源性PTEN蛋白的表达,比较高转移性癌细胞系与亲本细胞PTEN蛋白表达的差异。方法:应用ABC免疫组化染色法,检测8例癌细胞系PTEN蛋白的表达,包括舌癌细胞系Tca8113和HSC-3、口底癌细胞系HSC-2、颊癌细胞系BcaCD885、粘液表皮样癌细胞系MEC-1、腺样囊性癌细胞系SACC83以及高转移性舌癌细胞系Tb-TLP和高转移性粘液表皮样癌细胞系M3SP2。结果:5/8例癌细胞系PTEN蛋白的表达呈阳性,PTEN蛋白定位于靠近 细胞核周围的细胞质中。3/8例癌细胞系PTEN蛋白的表达呈阴性,即BcaCD885细胞及高转移性Tb-TLP和M3SP2细胞。结论:PTEN蛋白表达缺失与癌细胞转移可能有一定的关系。

猪FSP27基因过表达脂肪细胞系的构建与验证

脂肪特异蛋白27(FSP27)是一种新发现的定位在脂滴的蛋白质,在调控脂肪细胞内脂类贮存等方面起着重要作用。本试验用含有猪FSP27基因的慢病毒,感染鼠3T3-L1前脂肪细胞,建立猪FSP27基因过表达的前脂肪细胞系,为进一步研究猪FSP27基因在脂肪细胞中调控脂类代谢提供实验素材。根据猪的FSP27基因序列设计目的基因引物序列,并分别添加酶切位点Nhe I和Age I及保护碱基,克隆到p MD18-T载体做Nhe I和Age I双酶切,将酶切产物回收并将双酶切后的目的片段与GV341载体连接,转入293T细胞,包装成慢病毒,收集、浓缩、纯化病毒上清并用来感染3T3-L1前脂肪细胞,筛选稳定系,并检测感染效率和脂肪细胞表型变化。结果显示,猪FSP27基因过表达3T3-L1脂肪细胞中FSP27基因的相对表达量显著高于对照组(P<0.01),在过表达脂肪细胞培养第8天,脂肪细胞形成脂滴数量明显多于对照组(P<0.05),表明猪FSP27基因过表达3T3-L1脂肪细胞系构建成功。

表达人Jagged1基因的骨髓基质细胞系的建立及其在HL-60细胞分化过程中的作用

目的 :建立表达人Jagged1基因的骨髓基质细胞系 ,并研究Jagged1基因表达在HL 6 0细胞诱导分化过程中的作用。 方法 :构建含有人全长Jagged1基因的逆转录病毒载体MSCV Jagged1 /neoR ,将其导入包装细胞PT6 7并收获病毒上清 ,用病毒上清转染骨髓基质细胞系HFCL ,经G4 1 8筛选得HFCL pMSCV Jagged1细胞 ,用Western印迹方法检测Jagged1基因的表达 ;将HL 6 0细胞与HFCL pMSCV Jagged1细胞、HFCL细胞在含有全反式维甲酸 (ATRA )的培养液中共培养 ,流式细胞仪检测不同时间点HL 6 0细胞CD1 1b的阳性率。 结果 :Western印迹方法证明HFCL pMSCV Jagged1细胞Jagged1表达水平明显高于HFCL细胞 ;HL 6 0细胞与HFCL pMSCV Jagged1、HFCL共培养 4 8和 72h后 ,CD1 1b阳性率在Jagged1组明显低于HFCL组 (P <0 .0 5 )。 结论 :Jagged1基因表达可以较为显著地抑制ATRA诱导的HL 6

DNA甲基化调控K562细胞系kir3dl1基因表达

为分析kir3dl1基因启动子区的甲基化模式及其与基因表达的关系,探讨kir3dl1基因的表达调控机制,采用亚硫酸氢盐测序法检测K562细胞中kir3dl1基因启动子区的甲基化状况,应用甲基化抑制剂5-氮胞苷处理K562细胞以诱导CpG岛去甲基化,观察启动子区CpG岛甲基化与kir3dl1基因表达的关系。结果显示:K562细胞中kir3dl1基因核心启动子区CpG二核苷酸甲基化频率在20%-100%之间;K562细胞中kir3dl1基因启动子序列在转录因子E2F可能的结合位点上存在1个碱基的突变,并形成1个新的被甲基化的CpG二核苷酸;应用甲基化抑制剂5-氮胞苷可以诱导不表达kir3dl1基因的K562细胞重新表达该基因。结论:K562细胞中kir3dl1基因表达受启动子甲基化调控,对转录因子E2F的深入研究有助于了解其在kir3dl1基因表达调控中可能的作用。

人结肠癌细胞系中癌相关基因的表达及表型遗传修饰的影响

目的 观察DNA甲基化和组蛋白乙酰化对人结肠癌细胞系癌相关基因的表达和细胞周期的影响。方法 培养 2种结肠癌细胞系SW 1 1 1 6和Colo 32 0 ,分别以去甲基化制剂 5 氮脱氧胞苷 (5 aza 2′ deoxycytidine ,5 aza dC)和 (或 )组蛋白脱乙酰化酶 (histonedeacetylase ,HDAC)抑制剂trichostatinA(TSA)及丁酸盐干预细胞。提取细胞总RNA ,以RT PCR和定量RT PCR法研究抑癌基因p1 6 INK4A、APC、p2 1 WAF1 、p5 3和 p73以及癌基因c myc和c Ki ras、凋亡抑制基因survivinmRNA表达水平 ;并运用流式细胞术检测细胞周期变化。结果 正常情况下 ,SW 1 1 1 6和Colo 32 0细胞系中均有较弱的 p1 6 INK4A和APC表达 ;两种结肠癌细胞系 p2 1 WAF1 表达缺如 ,而 p5 3、p73和c myc、c Ki ras以及survivin均表达。以 5 aza dC干预后 ,p1 6 INK4A和APC表达增强 ,且不同的结肠癌细胞系表达增强最明显时 5 aza dC干预的时间与浓度不同。相反 p2 1 WAF1 仍无明显表达。值得注意的是这两个细胞系经TSA或丁酸盐处理后 ,p2 1 WAF1 转录水平显著上调。p5 3、p73、c myc、c Ki ras和survivin基因在干预前后表达无明显变化。另外 ,5 aza dC并不能改变细胞周期 ,而TSA或丁酸盐使细胞阻滞于G1 期。结论 两种人结肠癌细胞系中 ,p1

人肺腺癌亲代与耐顺铂细胞系耐药与凋亡相关基因表达差异及其相关性

目的 探讨人肺腺癌亲代与耐顺铂细胞系A549和A549DDP耐药及凋亡相关基因表达的差异 ,以及多药耐药的发病机制。方法 采用逆转录 PCR及免疫细胞化学方法检测A549和A549DDP细胞多药耐药相关蛋白 (MRP)、肺耐药蛋白 (LRP)、bcl 2及C erbB 2的表达水平。结果 逆转录 PCR结果显示 :A549细胞表达MRP、bcl 2及C erbB 2mRNA ,无LRPmRNA表达 ,A549DDP细胞亦表达MRP、bcl 2及C erbB 2mRNA ,且表达LRPmRNA ,耐药细胞MRP及C erbB 2mRNA表达水平较亲代显著增高 ,bcl 2mRNA表达水平与亲代无显著性差异 (P =0 731 ) ;A549DDP细胞血管生成因子及耐药相关基因mRNA表达水平较A549细胞显著增高 ,差异有显著性 (P =0 0 0 7)。免疫细胞化学结果显示 :亲代和耐药细胞bcl 2蛋白表达呈强阳性 ,亲代C erbB 2及LRP呈阴性 ,MRP轻度阳性 ,耐药细胞MRP蛋白呈中度阳性 ,C erbB 2及LRP轻度阳性。结论 A549细胞的原发耐药与耐药及凋亡相关基因MRP、C erbB 2和Bcl 2的异常表达和协同作用有关。A549DDP细胞MRP和C erbB 2的表达增强 ,且表达LRP ,可能是继发耐药的产生机制。

FLT3配基在人骨髓基质细胞系中的基因转移与表达

目的 :研究逆转录病毒介导的FL在骨髓基质细胞系HFCL中的表达。方法 :采用脂质体法将重组质粒pLF SN/HFCL和空载体 pLXSN/HFCL转染包装细胞PA317,G418筛选抗性克隆 ,用抗性克隆上清液感染HFCL。RT PCR和基因组DNA PCR检测外源基因mRNA水平的表达及染色体的整合 ,小鼠CFU GM集落法检测FL生物学活性。结果 :在mRNA水平有FL的表达 ,染色体基因组中整合有标记neo基因和FL基因。活性测试结果显示转染的骨髓基质细胞分泌FL。结论

稳定表达促血管生成素基因肝癌细胞系的建立及产物的检测

目的 构建携带促血管生成素 (Angiopoietin)基因并稳定表达的肝癌细胞系SMMC772 1,为进一步研究奠定基础。方法 选择本身不表达Angiopoietin的肝癌细胞系SMMC772 1,通过脂质体介导的基因转染方法将Angiopoietin基因导入SMMC772 1肝癌细胞系 ,并用G418筛选稳定表达的细胞克隆 ,构建携带Angiopoietin基因并稳定表达的SMMC772 1肝癌细胞系。用RT -PCR方法从RNA水平以及用免疫荧光法从蛋白水平均检测新构建的肝癌细胞系是否携带了Angiopoietin基因并能稳定表达其蛋白产物。结果 成功构建了携带Angiopoietin基因的肝癌细胞系 ,新的细胞系可以稳定表达外源基因及其蛋白产物。结论 脂质体介导基因转染法是一种高效转染方法 。

抑制AFP基因表达能直接抑制肝癌细胞系SMMC-7721增殖

甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)是哺乳动物胚胎时期由肝脏和软黄囊产生的一个主要的血清蛋白.在正常成人外周血中常常检测不到AFP的存在,而在肝癌患者外周血中,AFP常显著升高,是诊断原发性肝癌的一个重要的肿瘤标志物.

鸡溶菌酶基因3＇端MAR在同源细胞系对基因表达调控的研究

用带有鸡溶菌酶基因增强子（Ｅ）和启动子（Ｐ）的编码细菌氯霉素乙酰基转移酶（ＣＡＴ）的融合基因（ＥＰＣ），在其上游区、下游区或在上游和下游区同时插入鸡溶菌酶基因３＇端核基质附着区（ＭＡＲ）的不同表达载体ＭＥＰＣ、ＥＰＣＭ和ＭＥＰＣＭ，稳定转染鸡ＨＤ１１Ｐｒｏｍａｃｒｏｐｈａｇｅ同源细胞系，筛选不同表达载体稳定整合后的细胞株，检测ＣＡＴ表达水平，确定其表达基因拷贝数，从而分析鸡溶菌酶基因３＇端ＭＡＲ对基因表达的影响。稳定整合表达和瞬时表达实验结果表明，鸡溶菌酶基因３＇端ＭＡＲ在同源细胞系对基因表达没有激活作用，与该基因５＇端ＭＡＲ在同源或异源细胞系中能激活基因表达形成鲜明对照，说明５＇瑞ＭＡＲ和３＇端ＭＡＲ在调节鸡溶菌酶基因表达上存在一种协调关系。

GFP报道基因在鼻咽癌细胞系CNE-2Z中的表达

目的 观察GFP报道基因在鼻咽癌细胞系CNE 2Z中的表达。方法 将带有GFP报道基因的载体质粒pPAT GFP和 3种带有GFP报道基因及目的基因抗端粒酶核酶基因teloRZ的不同质粒 pGFPuro teloRZ 2 .1、pGFPuro teloRZ 7.1、pGFPuro teloRZ 7.7,转染到鼻咽癌CNE 2Z细胞系中 ,用荧光显微镜及流式细胞仪检测转染细胞在固定后的活细胞中GFP基因的表达情况。结果 GFP基因在活细胞中有表达 ,而在固定后无表达 ,且目的基因的插入影响GFP基因的表达。结论 GFP基因在转染了含目的基因质粒的鼻咽癌CNE 2Z细胞中稳定表达 ,可以在CNE

稳定表达外源野生型p53基因人胆囊癌细胞系的建立和鉴定

目的:建立稳定表达外源野生型p53(w tp53)基因的人胆囊癌细胞系。方法:在脂质体lipofec-tam ineTM2000介导下,将含有w tp53的真核表达质粒pCM V-p53导入胆囊癌细胞系GBC-SD中。经G 418筛选抗性克隆,扩大培养,建立转染克隆细胞系。用聚合酶链反应(PCR)证实外源野生型p53基因的整合,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹法分析目的基因及其蛋白表达。结果:野生型p53基因成功地导入胆囊癌细胞系GBC-SD,转染细胞中存在外源p53基因及蛋白的稳定表达。结论:GBC-SD胆囊癌细胞株能稳定表达外源野生型p53基因。

在HepG2细胞系上建立四环素(Tet-On)基因调控系统表达P4502E1(英文)

目的 在HepG2细胞系上建立四环素 (Tet On)基因调控系统 ,调控表达P4 5 0 2E1(CYP2E1)。 方法 先后转导调控蛋白基因及CYP2E1cDNA(已与四环素反应启动子整合 )入HepG2细胞。用多西环素调控CYP2E1的表达 ,用RT PCR和Westernblot检测其表达高低。结果 RT PCR和Westernblot均检测出CYP2E1被多西环素调控表达。结论 四环素 (Tet On)基因调控系统 (表达CYP2E1)已在HepG2细胞系上成功建立。

胃癌组织和肿瘤细胞系中AGO基因突变和表达的研究

目的 :筛查胃癌组织中AGO基因突变 ,检测不同肿瘤细胞系中AGO基因的表达情况。方法 :采用聚合酶链反应及变性高效液相色谱法 ,对 2 2例胃癌组织标本中AGO基因 β型全部外显子进行突变筛查 ;应用逆转录 聚合酶链反应法检测多种不同肿瘤细胞系中AGO基因α和 β型转录本的表达情况。 结果 :在所检全部胃癌组织中均未见AGO基因突变 ;AGO基因α和 β型转录本在所有不同肿瘤细胞系中均有不同程度的表达。结论 :AGO基因可能与胃癌的发生和发展无关 ,AGO基因表达缺失在肿瘤细胞中少见。