集胞藻PCC6803高效基因表达平台的构建与评价

针对蓝细菌代谢工程改造的需求,成功构建了可以在模式蓝细菌菌株集胞藻PCC6803中高效表达外源基因的3个基因组整合表达平台,以及1个可以在多株蓝细菌中表达的广宿主穿梭表达平台。该表达平台通过选用集胞藻PCC6803中1,5-二磷酸核酮糖缩化酶/氧化酶的启动子驱动外源基因的表达,应用"SD-AUG"翻译融合的策略提高外源蛋白翻译效率,以及加入终止子序列Trbc以提高转录终止效率,实现了对外源基因的高效表达。利用lacZ作为报告基因,检测了所构建表达平台pFQ20在集胞藻中的基因表达效率,结果显示β-半乳糖苷酶的活性为109 Miller。同时,基于pFQ20表达平台在集胞藻PCC6803中表达了来自大肠杆菌的硫酯酶基因tesA’,蛋白印迹实验结果显示了硫酯酶的成功表达。该表达平台为在蓝细菌中开展遗传研究及基因工程改造提供了有用的遗传工具,其构建策略为在蓝细菌中构建高效稳定的外源基因表达元件提供了借鉴。

公共引物介导的多重定量PCR技术在转基因大豆检测中的应用研究

目的建立公共引物介导的多重定量PCR法检测我国农业农村部允许进口的6种转基因大豆(包括:MON87701、DP356043、CV-127、MON87769、MON87705、MON87708)的方法。方法设计并筛选出针对本研究涉及的6种转基因大豆对特异性引物,在每对特异性引物的5’端均加上一段公共引物,形成特异性嵌合引物。以某种转基因大豆DNA为模板,加入多引物体系以及荧光公共引物验证GeXP(geneexpression platform)多重检测体系的特异性,每种转基因大豆DNA模板浓度分别稀释为20、2、1、0.2、0.02ng/μL,运用GeXP多重PCR方法进行单一DNA模板灵敏度分析并优化各对特异性嵌合引物的工作浓度。结果多重PCR检测体系扩增出特异性片段,GeXP检出的各转基因大豆片段长度MON87701、DP356043、CV-127、MON87769、MON87705和MON87708分别为140.75、184.42、274.93、308.47、467.98和517.67 bp, GeXP多重检测体系检测敏感性可达到为1 ng/μL,扩增产物测序结果进一步说明了引物扩增的特异性。结论本研究建立的基于GeXP系统的多重PCR定量检测技术,可以准确鉴别6种转基因大豆,为转基因大豆及其他转基因产品提供了新型的检测方法。

8种猪呼吸道和繁殖障碍病病原体GeXP检测方法的建立

【目的】建立了一种同时鉴别H1、H3亚型猪流感、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪瘟、猪日本乙型脑炎、猪圆环病毒病、猪细小病毒病和猪伪狂犬病8种病毒性呼吸道和繁殖障碍病病原体的GeXP高通量检测方法。【方法】根据这8种病原体的基因保守序列,设计并合成了9对特异性引物,在每对特异性引物的5＇端均加上一段通用引物,形成特异性嵌合引物。运用GeXP单重PCR方法,以单一病毒cDNA/DNA为模板验证引物的可行性;建立GeXP多重PCR方法,以单一病毒cDNA/DNA模板、阳性cDNA/DNA混合模板验证GeXP多重检测体系的特异性和准确性;将含猪圆环病毒、猪细小病毒和猪伪狂犬病病毒靶基因的克隆质粒及体外转录的RNA（H1、H3亚型猪流感、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪瘟、猪日本乙型脑炎）分别梯度稀释为10^3,10^2,10^1拷贝/μl,运用GeXP多重PCR方法进行单一病原体灵敏度分析;根据单一病原体的灵敏度分析结果,优化各对特异性嵌合引物的工作浓度,将含有体外转录好的6种RNA模板和3种克隆质粒等量混合,将混合物梯度稀释为10^4,10^3,10^2,10^1拷贝/μl,运用GeXP多重PCR方法分析同时检测8种病原体的灵敏度。运用建立好的GeXP多重检测体系对23份临床样品进行检测,并与常规单重PCR进行比较,对该GeXP多重检测体系的临床应用进行评价。【结果】基于GeXP系统的单重PCR检测体系和GeXP多重PCR检测体系均能扩增出特异性片段,验证了引物的可行性、GeXP多重检测体系的特异性和准确性;GeXP多重检测体系的单一病原模板灵敏度分析结果显示,多重检测体系对单一病原体检测的下限均为10-1拷贝/μl;GeXP多重检测体系在8种病原体同时检测的灵敏度分析结果显示,多重检测体系可在10^3拷贝/μl水平可同时检测到8种病原体;比较GeXP多重PCR检测方法和常规PCR方法对临床样品的检测结果,两种检测方法的检测结果相符。【结论】成功建立了基于GeXP系统的多重PCR检测体系,可以同时检测8种猪呼吸道和繁殖障碍性疾病病原体;本研究建立的同时鉴别8种猪呼吸道和繁殖障碍性疾病病原体的GeXP检测方法具有高通量、特异性强和灵敏度高的特点,为猪病毒性呼吸道和繁殖障碍性疾病的分子诊断提供了新型的检测方法。