反义RNA基因表达调控系统

本文概述了原核生物和真核生物反义RNA的研究进展,介绍了细胞内天然反义RNA基因表达调控系统及其可能的调控机制。

基于核糖开关的新型基因表达调控系统的应用

核糖开关是能对细胞环境的改变做出反应的顺式作用元件,通过改变自身的构象实现对基因表达的调控。基于核糖开关调控方式简洁,无需蛋白质参与,响应迅速,且自身片段小,结构简单,易于设计和改造等特性使其在生物医学领域体现出诸多应用优势。对核糖开关的结构,调节机理以及这种新型基因表达调控系统在基因治疗、抗生素新靶点的开发、病毒疫苗的安全控制、新型核糖选择器和生物体内传感器的应用进行了综述,旨为启示我国核糖开关的新型应用。

一种新型的生物素诱导的真核基因表达调控系统的建立

为建立一种适用于生物制药工业和基因治疗领域的基因表达调控系统,构建枯草芽胞杆菌生物素连接酶(BS-BirA)与转录激活结构域的融合蛋白,以其表达载体为调控载体;在弱化的CMV启动子上游连接BS-BirA特异的操纵子序列,获得响应载体,从而得到响应于生物素的真核基因表达调控系统BS-Biotin-On。以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因对该系统进行考察,结果表明,与现有的类似调控系统相比,该系统具有良好的诱导率;可通过调节培养体系中生物素的浓度,实现对目的基因表达水平快速、较高效的调节。上述结果表明,BS-Biotin-On系统可能为外源基因的调控表达提供新的选择。

基于Tet-On系统构建Alb启动子调控猪uPA转基因表达的慢病毒载体

目的应用Tet-On基因表达调控系统构建Alb启动子调控小型猪uPA (pig urokinase-type plasminogen activator,puPA)基因表达的慢病毒载体pLVX-Alb-TetOne-TRE-puPA-T2A-CopGFP(pLATTPUTG)。方法首先将pAlb-Cre-GH/BS作为模板,PCR扩增目的基因Alb-enhancer/promoter,In-Fusion克隆至Xho I/Xba I双酶切的pLVX-TetOne中,获得Alb启动子替换pLVX-TetOne原有的PGK启动子的质粒pLVX-Alb-TetOne;接着以pCD823 A-1为模板,PCR扩增T2A-CopGFP,In-Fusion克隆至BamH I/Age I酶切的pLVX-Alb-TetOne中,获得pLVX-Alb-TetOne-TRE-T2A-CopGFP(pLATTTG);最后以H8803为模板,PCR扩增puPA(3′端含Flag标签),In-Fusion克隆至pLATTTG中,最终获得慢病毒载体pLVX-Alb-TetOne-TRE-puPA-T2A-CopGFP (pLATTPUTG);所构建的质粒均经酶切和测序鉴定。pLATTPUTG瞬转293T细胞,转染24 h后倒置荧光显微镜检测绿色荧光;随后六孔板内加入强力霉素(Dox),48 h后倒置荧光显微镜下检测CopGFP表达(包括未加Dox的孔),接着收集细胞以抽提总RNA和总蛋白,以用于qRT-PCR检测puPA和CopGFP表达及Western blot检测Flag表达。结果酶切鉴定和测序证实成功构建了慢病毒载体pLATTPUTG。pLATTPUTG转染293T细胞,24 h后倒置荧光显微镜下未见绿色荧光,而加入Dox 48 h后几乎所有细胞均发强的绿色荧光,而不加Dox的孔内仍然未见绿色荧光;加Dox的孔内细胞上puPA、CopGFP和Flag表达水平均显著升高,而不加Dox的孔内细胞上检测到上述基因极低表达;以上数据提示,应用该Tet-On基因表达调控系统实现了puPA基因在293T细胞上可诱导性表达。结论成功基于Tet-On基因表达调控系统构建Alb启动子调控puPA转基因表达的慢病毒载体pLATTPUTG,这为相关后续研究奠定了坚实基础。

四环素调控SV40Tag转基因小鼠模型的建立

目的构建四环素调控的SV40T转基因小鼠模型。方法同时显微注射外源基因p205-rtTA-C3和pTRE-Tag至FVB小鼠原核,注射受精卵移植到同期发情的假孕受体出生个体,经PCR和Southern检测获得阳性转基因小鼠。结果经PCR结合Southern检测得到rtTA和Tag双阳性转基因小鼠一只,rtTA单阳性两只和Tag单阳性一只。结论通过饮水给与四环素的双阳性小鼠可在卵巢中检测到Tag mRNA的表达。

条件性SV40 TAg转基因小鼠模型的建立

目的建立可调控的脑组织特异性表达SV40 TAg的转基因小鼠模型。方法构建由大鼠神经元特异性烯醇化酶基因(rat neuron-specific enolase,NSE)启动子驱动四环素基因表达调控系统的载体,从而控制SV40 TAg基因的表达;受精卵雄原核显微注射该线性化载体制备转基因小鼠;PCR方法鉴定首建鼠;RT-PCR方法检测小鼠组织中四环素反式激活子(rtTA)及SV40 TAg基因的表达情况。结果显微注射获得17个首建鼠,其中的6个首建鼠建系成功;1#、6#品系小鼠的脑组织中表达rtTA基因;强力霉素诱导后,可检测到6#品系小鼠脑组织中SV40TAg基因的特异性表达。结论可调控的脑组织表达SV40 TAg的转基因小鼠模型已经建立。

利用Tet-on调控系统建立人肝癌HepG2^(Tet-on)细胞系

目的构建可以用强力霉素调控表达的人肝癌HepG2Tet-on细胞系,为进一步研究肝癌相关基因功能奠定基础。方法用脂质体转染法将pWHE146质粒转染到人肝癌HepG2细胞中,用G418筛选出稳定表达细胞克隆;单克隆分别扩增后,瞬时转染pTRE-hyg-luc质粒;强力霉素诱导表达后,检测荧光素酶表达活性,挑选出受强力霉素调控的低背景、高表达的HepG2Tet-on细胞株。结果成功构建了一株受强力霉素调控的高表达低背景的HepG2Tet-on细胞株(诱导倍数达154.106倍)。结论HepG2Tet-on细胞株可用于外源基因的真核调控高表达,为研究真核基因功能提供一种可靠的细胞株。

四环素阻遏-蛋白与热激因子融合转录激活子的构建

为构建一新型低毒且受四环素负调控的基因表达调控系统,克隆了大肠杆菌XL1-BLUE四环素阻遏蛋白基因TetR和拟南芥热激因子基因Athsf1a缺失片段AtHSFC157,将两基因融合获得TetR:AtHSFC157融合片段作为四环素调控系统转录激活子,将其克隆入表达载体pXNSC2020中,成功构建了四环素负调控系统p35SC157-Om35Sgus。采用冻融法将其导入根癌农杆菌EHA105中,并通过农杆菌介导烟草叶片瞬间表达,以组织化学法检测GUS基因表达活性;结果在不加四环素处理条件下组织化学法检测到很强的GUS活性,而在含有1mg/L四环素的培养基中培养却没有检测到GUS活性;结论表明该技术所构建的新型四环素调控系统具有典型的受四环素负调控功能。

高等植物与环境互动响应关系—农业可持续发展的根本基础(英文)

高等植物与环境相互响应关系涉及到了几乎所有的生命过程,它是全球不同类型可持续发展的根本基础,尤其是农业可持续发展的最重要基础.如何调控上述作物与相应环境(尤其土壤环境)的关系是全球气候变化条件下现代可持续农业的关键问题,植物生物学研究领域的前沿热点问题之一.详细解析这个相互响应关系对于从事全球的生态恢复与建设也有重要意义.尽管相关于基因组学,后基因组学和代谢组学的有力方法和数据库已经为上述关系的机理研究提供了部分清晰的轮廓,但是植物生理学措施仍然是作物性状田间发挥的必要保证.随着供试植物范围的扩大以及现代整合分子生物学的发展,对于生物与非生物胁迫下的这个响应关系机制的完全理解将得到加速.