蛋白酶体抑制剂MG-132对大鼠骨骼肌成肌调节因子MyoD基因表达的实验研究

泛素-蛋白酶体通路是失神经骨骼肌分解代谢的主要途径，其对蛋白底物的水解作用，可以被蛋白酶体抑制剂所阻断，从而影响细胞的一系列生理功能。Grace等研究表明，损伤后的骨骼肌再生及发育都受成肌调节因子（myogenic regulatory factors，MRFs）家族的调节。包括MyoD、Myogenin、Myf5、MRF4。其中，MyoD基因是决定骨骼肌细胞分化的决定性基因。

血管内皮细胞中核因子-κB对靶基因的转录调节

血管内皮细胞不仅是生物体内重要的生物屏障,而且还具有内分泌功能。核因子(NF) κB在 血管内皮细胞中可被许多刺激激活,而且很多与炎症反应有关的基因都含有NF κB结合位点。 NF κB/IκBα系统在血管内皮细胞激活中起着关键作用,NF κB有可能成为炎症反应的治疗靶点。

干扰素调节因子-5 rs2004640的T等位基因与类风湿关节炎的临床表现的相关性

目的探讨干扰素调节因子-5(IRF-5)rs2004640位点T等位基因与类风湿关节炎(RA)的临床表现的相关性。方法采用聚合酶链反应-连接酶检测反应(PCR-LDR)对136例RA患者进行IRF-5rs2004640位点的单核苷酸多态性(SNP)分型。记录患者的临床表现、X线分期,检测红细胞沉降率、类风湿因子水平。结果 X线分期为Ⅲ+Ⅳ期组RA患者的T等位基因阳性率显著高于Ⅰ+Ⅱ期组(P=0.018)。关节外表现<3个的RA患者的T等位基因阳性率显著多于关节外表现≥3个的RA患者(P<0.01)。结论 IRF-5 rs2004640 T等位基因与RA患者关节破坏程度(X线分期)和关节外表现有关。

干扰素调节因子-6基因多态性与非综合征型唇腭裂的相关性研究

20世纪80年代后期以来,学者们陆续报道了10～20个与非综合征型唇腭裂有关的易感基因和位点,其中干扰素调节因子-6(IRF-6)基因是迄今发现的最有价值的与非综合征型唇腭裂发病相关的基因之一。本文就IRF-6基因的结构和功能、IRF-6基因的多态性及其与非综合征型唇腭裂的相关性研究作一综述。

肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ对人嗜碱性粒细胞中Toll样受体基因表达的调节作用

目的:探讨肿瘤坏死因子α(TNFα)和干扰素γ(IFNγ)对人嗜碱性粒细胞中Toll样受体(TLR)基因表达的调节作用。方法:用逆转录聚合酶链反应检测人嗜碱性粒细胞系(KU812)中,TLR1～10mRNA的组成型表达;用实时定量聚合酶链反应检测TNFα或IFNγ刺激KU812细胞后,TLR1～10mRNA表达的变化。结果:人嗜碱性粒细胞有TLR1～10mRNA的组成型表达,其中TLR1～6和TLR9的mRNA表达量较高,而TLR7,8和TLR10mRNA的表达量相对较少。TNFα可明显上调TLR2～4mRNA的表达,而IFNγ对TLR2和TLR9的mRNA表达有明显的上调作用。结论:人嗜碱性粒细胞不仅参与了天然免疫,而且其免疫功能还受到细胞因子的调节。

N-myc下游调节基因-2在大鼠肠缺血再灌注肺损伤中的表达及其与NF-κBp65的相关研究

目的通过建立大鼠肠缺血再灌注肺损伤(IIRI)模型,观察大鼠肠缺血再灌注肺损伤,肺组织中N-myc下游调节基因-2(NDRG2)表达水平的变化。方法 50只健康成年雄性SD大鼠随机分成对照组(control)、缺血再灌注组(I/R)(其中根据缺血再灌注时间又分4个亚组),每组10只。缺血再灌注4个亚组选择缺血60min后分别再灌注30、60、120和180min,获取样本肺组织。术后样本行病理(HE)、湿干重比例(W/D)检测,免疫组化、Western-blot对NDRG2、核转录因子-κBp65(NF-κBp65)检测,RT-PCR方法对NDRG2在mRNA水平含量进行检测,TUNEL法对凋亡细胞进行检测。结果缺血再灌注组与对照组比较,缺血再灌注组肺泡壁增宽,肺泡腔内可见出血等炎症表现,W/D比值显著性升高(P<0.05),免疫组化显示NF-κBp65发生核转位现象,NF-κBp65蛋白水平表达明显升高(P<0.05),肺组织NDRG2在mRNA水平和蛋白水平的表达明显降低(P<0.05)。结论缺血再灌注损伤可下调肺组织中NDRG2的表达,NDRG2可能通过对NF-κB通路进行调控,是导致缺血再灌注后肺损伤的靶向调控位点,对肠缺血再灌注肺损伤的大鼠起保护作用。

干扰素调节因子-1和CD74的表达变化与自发性高血压大鼠源大血管平滑肌细胞增殖相关

目的：借助体外模型验证IRF-1、CD74、CD36、GAP43、CYP2E1和TCA4基因表达变化是否与糖尿病大血管病变相关。方法：取自发性高血压大鼠胸主动脉平滑肌细胞，并将其分别培养于含不同浓度葡萄糖（5．5、15、25、30mmol／L和35mmol／L）、波动糖中（25mmol／L和5．5mmol／L葡萄糖交替，每一浓度持续12h）以及持续高糖（25mmol／L）中，48h后运用半定量RT—PCR检测IRF-1、CD74、CD36、CYP2E1和TCA4的表达变化，SPSS分析基因变化与平滑肌增殖的相关性。结果：葡萄糖浓度低于30mmol／L时，平滑肌细胞的增殖随糖浓度的增加而加速。持续高糖中培养平滑肌细胞自第6h起增殖明显。统计分析显示，CD74、IRF-1和GAP43的表达变化与平滑肌细胞的增殖存在相关性。结论：IRF-1和CD74参与调节糖尿病大血管病变中平滑肌细胞的增殖。

转化生长因子-α对应激状态下胃粘膜适应性细胞保护的调节作用

目的 研究转化生长因子 α(TGF α)对水浸束缚应激 (WRS)状态下大鼠胃粘膜乳癌相关肽 ( pS2 )、肠三叶因子 (ITF)基因表达、胃粘膜血流量 (GMBF)及适应性细胞保护的调节作用。方法 采用重复水浸束缚应激制作模型 ,动态监测胃粘膜血流量 ,大体及光镜下观察粘膜损伤程度(UI)及组织学变化 ,逆转录 多聚酶链反应 (RT PCR)检测TGFα、pS2 及ITF基因表达变化。结果 单次应激造成胃粘膜广泛损伤 ,重复应激后胃粘膜产生适应性 ,胃粘膜血流量上升 ,损伤逐渐减轻 ,4次应激后 ,损伤指数降低为单次应激的 2 1 .99%,并且胃腺区细胞增殖 ,TGF α、pS2 及ITF基因表达增强 [分别为 ( 0 .86± 0 .0 1 )vs( 0 .93± 0 .0 1 ) ,P <0 .0 1 ;( 0 .37± 0 .0 2 )vs( 0 .77± 0 .0 1 ) ,P <0 .0 1 ;( 0 .0 4 0± 0 .0 0 1 )vs( 0 .372± 0 .0 1 ) ,P <0 .0 1 ],TGFα 与 pS2 及ITF均成正相关。结论 胃粘膜适应性细胞保护伴有细胞增殖 ,TGFα 对应激状态下胃粘膜 pS2 、ITF基因表达。

CD4^+ CD25^+调节性T细胞和细胞因子与异基因造血干细胞移植后aGVHD的相关性研究

本研究旨在研究异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)、细胞因子IL-2、TGF-β水平与受者急性移植物抗宿主病(aGVHD)的相关性。采用流式细胞术检测13例allo-HSCT患者术后外周血Treg细胞在CD4+T细胞中的百分比;用ELISA法检测其血清IL-2和TGF-β水平。结果表明:13例患者均获造血重建,non-aGVHD4例,Ⅰ-Ⅱ度aGVHD5例,Ⅲ-Ⅳ度aGVHD4例。non-aGVHD组Treg在CD4+T细胞中所占的百分比高于aGVHD组,差异有显著性(p<0.05);non-aGVHD组血清IL-2水平低于aGVHD组,差异有显著性(p<0.05);non-aGVHD组血清TGF-β水平高于aGVHD组,差异有显著性(p<0.05)。结论:外周血Treg、IL-2、TGF-β水平与allo-HSCT后aGVHD的发生及严重程度有密切关系,因此可作为早期判断和监测aGVHD的指标。

肿瘤坏死因子-α基因启动子多态性与慢性乙型肝炎易感性的关系

目的探讨湖北汉族人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因启动子多态性及其与慢性乙型肝炎易感性之间的关系。方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析方法(RFLP),检测126名正常对照者和131例慢性乙型肝炎患者TNF-α基因启动子多态性。结果共发现12种启动子基因型,以GG.GG.CC.CC、GG.GG.CC.CA、GG.GG.CT.CC和GG.GA.CC.CC基因型多见,约占85%;通过对TNF-α基因启动子4个位点基因型分析发现,慢性乙型肝炎患者和正常对照者TNF-α基因启动子-238G/A、-857C/T位点基因型分布频率差异无显著性,而-308G/A、-863C/A位点基因型分布频率差异有显著性。结论湖北汉族人慢性乙型肝炎易感性与TNF-α基因启动子-308G/A、-863C/A位点多态性有关,其中TNF-α-308GA、-863CA基因型携带者患慢性乙型肝炎风险相对较小。

PRRSV-GP5蛋白对干扰素调节因子-3磷酸化的影响

为了研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)-GP5蛋白对干扰素调节因子-3(IRF-3)磷酸化的影响,试验根据PRRSV CH-1a毒株核苷酸序列,设计并合成用于扩增PRRSV-GP5基因的特异引物,将目的基因扩增产物与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,转染Marc-145细胞,间接免疫荧光试验鉴定目的蛋白的表达,应用SDS-PAGE和Western-blot分析GP5对IRF-3的影响。结果表明:经RT-PCR扩增,得到的GP5基因大小与预期一致;间接免疫荧光试验证明,GP5蛋白在Marc-145细胞中成功表达;SDS-PAGE和Western-blot分析显示,GP5基因可以抑制IRF-3的磷酸化。

复方ANBP启动修复基因Ski双向调节TGF-β/Smad对小鼠创面愈合的影响

目的探讨复方ANBP(由仙鹤草、藕节、乳香、蒲黄组成)促进全层皮肤缺损小鼠愈合的分子机制。方法将C57BL/6小鼠随机分为空白对照组、ANBP组,每组随机分为6 h、3 d、7 d、14 d 4个时间点亚组,制备小鼠背部全层皮肤缺损模型。造模后空白对照组不做任何处理,ANBP组创面覆盖复方ANBP粉末。用免疫组织化学方法检测组织中转化生长因子(TGF)-β1、Sam和Mad同系物(Smad)2/3、Ski基因的蛋白表达量。结果 TGF-β1、Smad2/3的免疫组化结果显示:空白对照组从造模后6 h开始蛋白表达量逐渐升高,造模后7 d达到峰值,造模后14 d降低;ANBP组从造模后6 h开始蛋白表达量逐渐升高,造模后3 d达到峰值,造模后7~14 d蛋白表达量逐渐降低;与空白对照组相比,造模后3 d,ANBP组蛋白表达量显著增高(P<0.05);造模后14 d,ANBP组蛋白表达量显著降低(P<0.05)。TGF-β1蛋白表达量除6 h外,其他各时间点差异均具有统计学意义(P<0.05),Smad2/3蛋白表达量差异均具有统计学意义(P<0.05);Ski的免疫组化结果显示:空白对照组从造模后6 h开始蛋白表达量逐渐升高,造模后3 d达到峰值,造模后7~14 d逐渐降低;ANBP组从造模后6 h开始到14 d蛋白表达量逐渐升高。与空白对照组相比,造模后3 d,ANBP组蛋白表达量显著降低(P<0.05);造模后7~14 d,ANBP组蛋白表达量显著升高(均P<0.05)。结论复方ANBP通过启动关键修复基因Ski双向调节TGF-β/Smad通路,从而促进小鼠背部皮肤创面愈合。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子-1基因与糖尿病

过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子(PGC)-1基因作为一个细胞核转录因子,在许多基因转录及转录后的剪接修饰中起重要作用,尤其与能量代谢关系密切。 PGC-1富含于肝脏、骨骼肌和棕色脂肪组织,调节糖、脂代谢及线粒体生物合成,并参与脂质分化及适应性产热过程。本文着重对PGC-1调控基因表达的分子机制及其在糖尿病发病中的作用作一综述。

N-myc下游调节基因对胰腺癌细胞增殖、侵袭及迁移的影响及其机制研究

目的探究N-myc下游调节基因(NDRG1)对胰腺癌细胞增殖、侵袭及迁移的影响,并分析可能的机制。方法体外培养人胰腺癌细胞系MZ-3262细胞,并分为空白对照组(细胞不做特殊处理)、pcDNANC组(细胞转染pcDNA-NC)、pcDNA-NDRG1组(细胞转染pcDNA-NDRG1)、通路抑制剂组[转染pcDNA-NDRG1后加入含终浓度为1 mmol/L磷脂肌醇3-激酶(PI3K)通路激活剂bpv的培养液];采用实时荧光定量聚合酶链反应检测NDRG1 m RNA的表达;CCK-8法检测细胞存活情况;划痕实验、Transwell实验分别检测细胞迁移、侵袭能力;Western blotting检测NDRG1、增殖及侵袭迁移相关蛋白[细胞增殖相关核抗原(PCNA)、E-钙黏附蛋白(E-Cadherin)、N-钙黏附蛋白(N-Cadherin)、波形蛋白(Vimentin)]及蛋白激酶B/转录激活因子3(Akt/STAT3)通路蛋白[PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、STAT3]的表达。结果与空白对照组、pcDNA-NC组比较,pcDNA-NDRG1组、通路激活剂组MZ-3262细胞NDRG1 mRNA和蛋白、E-Cadherin蛋白相对表达量升高(P<0.05),细胞存活率、侵袭细胞数、划痕愈合率、PCNA、N-Cadherin、Vimentin蛋白及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-STAT3/STAT3相对表达量降低(P<0.05);但通路激活剂组MZ-3262细胞NDRG1 mRNA和蛋白、E-Cadherin蛋白相对表达量低于pcDNA-NDRG1组(P<0.05),细胞存活率、侵袭细胞数、划痕愈合率、PCNA、N-Cadherin、Vimentin蛋白及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-STAT3/STAT3相对表达量高于pcDNA-NDRG1组(P<0.05)。结论过表达NDRG1表达可能通过抑制PI3K/Akt/STAT3通路活化,抑制胰腺癌MZ-3262细胞增殖、侵袭及迁移。

pErk1/2在干扰素-γ对干扰素调节因子-1沉默后表达Akt的32D细胞生长中的作用

目的 :运用siRNA沉默干扰素调节因子-1(IRF-1)基因,观察干扰素-γ(IFN-γ)对IRF-1沉默后表达Akt的32D细胞生长增殖的作用,探讨IFN-γ由抑制造血逆转为促进造血的机制。方法 :培养表达野生型Akt与无活性型Akt的32D细胞并分别转染,针对IRF-1-siRNA质粒以沉默IRF-1基因,用实时定量聚合酶链反应检测沉默效果,Western-blotting检测IRF-1蛋白表达以验证沉默效果。将处于对数生长期的两株细胞分成3大组:siRNA干扰组、空质粒阴性对照组及空白对照组,前两组分别加入不同浓度的IFN-γ共孵育,用MTS法检测两株细胞增殖情况。用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;用Western-blotting检测p-Erk1/2表达。结果:(1)加IFN-γ24h后,IRF-1沉默组在IFN-γ低浓度时促进增殖,抑制凋亡。高浓度的IFN-γ仍抑制增殖,促进凋亡。在48h以后IRF-1沉默组各浓度的IFN-γ都促进增殖,抑制凋亡(P<0.05)。(2)表达野生型Akt的32D细胞在各时间点的增殖比例都大于表达无活性型Akt的细胞。且凋亡率都小于表达无活性型Akt的各组细胞,两者在48h比较差异有统计学意义(P<0.05)。(3)表达无活性型Akt的32D细胞,加入IFN-γ后各组均上调了pErk1/2的表达(P<0.05)。但IRF-1沉默前后,各组pErk1/2表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。表达野生型Akt的32D细胞,在IRF-1沉默后各浓度IFN-γ均下调pErk1/2的表达(P<0.05)。结论:(1)IRF-1在IFN-γ的促凋亡作用中起重要作用。(2)有活性Akt的表达可抑制Erk信号通路,其活性状态决定了IRF-1封闭后IFN-γ对pErk1/2表达的作用,pErk1/2的表达影响细胞增殖与凋亡,但并不决定IFN-γ作用的逆转。(3)Akt信号通路在IFN-γ逆转机制中起作用。

鸡IL-18基因的克隆与序列测定

根据Genbank发表的鸡IL-18基因序列,设计一对引物,提取鸡脾细胞总RNA,经RT-PCR扩增和扩增产物的克隆、测序,获得了中国江西土鸡IL-18基因片段,其大小为597bp,与Schneider报道的鸡IL-18基因序列完全一致,为进一步研究鸡IL-18的基因表达、生物学活性和应用奠定了基础。

转染NDRG1基因对宫颈癌细胞COX-2、VEGF表达及增殖的影响

目的:通过研究人类N-myc下游调节基因1(N-myc downstream regulated gene 1,NDRG1)对人宫颈癌SiHa细胞环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达及细胞增殖的影响,深入探讨NDRG1抑制宫颈癌侵袭转移的作用机制。方法:经脂质体介导将含有NDRG1真核表达质粒转染人宫颈癌SiHa细胞株,采用G418筛选阳性细胞克隆及RT-PCR、蛋白质印迹鉴定;蛋白质印迹法检测阳性克隆细胞COX-2及VEGF表达的改变;噻唑盐(MTT)比色法检测阳性细胞克隆的增殖活性。结果:成功建立高表达NDRG1的阳性SiHa细胞克隆(N-12),并证实其COX-2和VEGF蛋白表达及细胞增殖活性均显著降低。结论:NDRG1可能通过下调宫颈癌细胞COX-2、VEGF的表达及抑制细胞增殖而起到抑制宫颈癌进展的作用。

TGF-β1上调CD4^+CD25^+调节性T细胞FOXP3的表达

目的探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)在肺癌患者CD4+CD25+调节性T细胞比例增高中发挥的作用。方法采用酶消化法培养原代肺癌细胞,将培养的肺癌细胞及肺癌细胞培养上清液分别与自身来源的外周血单个核细胞共培养,不同浓度(2、51、0 ng/ml)的TGF-β1进行干预后,检测各组CD4+CD25+调节性T细胞标志物FOXP3 mRNA的表达。结果肺癌细胞与外周血单个核细胞共培养组FOXP3 mRNA的表达呈阳性,且随着TGF-β1干预浓度的增加,FOXP3 mRNA的表达强度逐渐增高,两者呈正相关(r=0.663,P<0.05);外周血单个核细胞经肺癌细胞培养上清液孵育后亦有FOXP3 mRNA的表达,TGF-β1干预后,FOXP3 mRNA的表达虽有上调但与干预前相比,差异无显著性意义(P>0.05)。结论TGF-β1能上调外周血单个核细胞中FOXP3的表达,即增加CD4+CD25+调节性T细胞的比例,从而参与肺癌免疫逃逸机制。