NT3基因转染对噪声性耳聋的影响研究

目的验证阳离子脂质体介导神经营养因子3(Neurotrophin-3,NT3)基因转染对噪声致豚鼠耳聋的保护作用。方法选取广西医科大学动物实验中心提供的60只健康花色黑目豚鼠为研究对象,按随机数字表法分为5组,每组12只(实验过程中部分动物死亡,实际实验数据按每组10只统计)。Ⅰ组未受噪声影响,Ⅱ组注入人工外淋巴液未受噪声刺激,Ⅲ组注入人工外淋巴液后受噪声刺激,Ⅳ组在注入空质粒后受噪声刺激,V组在注入含NT3基因的质粒后受噪声刺激。噪声为4 kHz的稳态白噪声,强度100 dB,8 h/d,连续10 d,休息5 d,再通过听性脑干反应(Auditory Brain-Stem Response,ABR)测试和免疫组织化学染色来评估听阈变化和耳蜗螺旋神经节细胞中NT3蛋白的表达情况。结果V组ABR阈值高于Ⅰ、Ⅱ组,但低于Ⅲ、Ⅳ组,差异有统计学意义(P均<0.05)。耳蜗螺旋神经节细胞处NT3蛋白表达量以V组较其余各组更高,差异有统计学意义(P均<0.05)。结论NT3基因转染后阈值增幅减小,听功能受损有一定程度减轻,对噪声致豚鼠耳聋具有一定程度的保护作用。

超声靶向微泡破坏技术介导基因转染在乳腺癌治疗中的研究进展

乳腺癌全球发病率逐年上升,严重威胁女性健康。近年来,随着生物技术的快速发展,基因治疗在乳腺癌中的研究日益增多。超声靶向微泡破坏作为一种潜在的基因或药物递送系统,既可作为载体,又可增加生物屏障的通透性,从而提高肿瘤的治疗效果,已广泛应用于乳腺癌基因治疗研究。考虑到常规基因载体的固有缺陷,研究者倾向将其与超声靶向微泡破坏技术联合应用以提高基因转染的安全性和有效性。本文对超声靶向微泡破坏技术及其与常规基因载体联合介导基因转染治疗乳腺癌的研究进展做一综述。

靶向超声微泡介导VEGF基因转染对薄型子宫ER的影响研究

目的:研究靶向超声微泡介导血管内皮生长因子(VEGF)基因转染对薄型子宫内膜容受性(ER)的影响。方法:选择40只性成熟但未交配的具有动情周期的雌性SD大鼠进行研究。将其随机分为四组,包括正常组10只,模型组10只,阴性对照组10只,治疗组10只。其中模型组、阴性对照组及治疗组大鼠均自宫角处注入95%无水乙醇贮留5 min制备薄型子宫模型,正常组自宫角处注入生理盐水,贮留5 min。模型组予以生理盐水注射治疗,阴性对照组予以超声微泡+抗体(不含基因)治疗,治疗组则以靶向超声微泡介导VEGF基因转染治疗。比较四组大鼠子宫内膜厚度及腺体数量,子宫内膜血流灌注,子宫内膜VEGF及白血病抑制因子(LIF)水平。结果:正常组子宫内膜厚度及腺体数量均高于模型组、阴性对照组及治疗组,治疗组子宫内膜厚度及腺体数量均高于模型组、阴性对照组(P<0.05)。正常组阻力指数(RI)、搏动指数(PI)、脐动脉收缩压与舒张压比值(S/D)均低于模型组、阴性对照组及治疗组,治疗组RI、PI、S/D均低于模型组、阴性对照组(P<0.05)。正常组子宫内膜VEGF、LIF水平均高于模型组、阴性对照组及治疗组,治疗组子宫内膜VEGF、LIF水平均高于模型组、阴性对照组(P<0.05)。结论:靶向超声微泡介导VEGF基因转染可有效修复子宫内膜,改善ER,值得临床重点关注。

基因转移的发展及其应用

把遗传物质从一个细胞转入另一个细胞,大大推动了动物遗传学和基因表达调控的研究。这种遗传物质的转移最初是通过细胞融合来实现的,然而细胞融合只能把两套遗传物质合并起来,却不能有选择地把特定的基因转入细胞中。基因转移技术的出现则满足了这一目的。目前基因转移已广泛应用于基因的表达、基因的结构与功能、基因的分离、基因治疗及生物品种的改良等许多领域。

CTLA4Ig基因转染猪皮敷料对患儿Ⅱ度烧伤炎症反应的影响

目的:观察人细胞毒T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4 immunoglobulin,CTLA4Ig)基因转染猪皮敷料在患儿Ⅱ度烧伤治疗中对炎症反应的影响。方法:抽取我院基因转染猪皮治疗急性烧伤的患儿40例作为观察组,银离子敷料治疗烧伤的患儿40例作为对照组。对比两组烧伤患儿的住院时长、发热天数,以及治疗前后的白细胞计数(WBC)、中性粒细胞百分比(NEUT%)、C-反应蛋白(CRP)、血清降钙素原(PCT)4种炎症指标的表达水平。结果:基因转染猪皮观察组患儿住院时间为(15.23±5.58)d,短于对照组的(18.85±11.47)d。观察组患儿发热天数为(3.60±2.35)d,少于对照组(P<0.05)。观察组患儿治疗后的WBC、CRP、PCT水平均低于对照组,且降低幅度均高于对照组(P<0.05)。结论:CTLA4Ig基因转染猪皮敷料治疗小儿Ⅱ度烧伤创面具有缩短发热时间、降低炎症反应的优点。

阳离子脂质体介导的基因转移机制

背景:与病毒载体相比,许多天然与合成的阳离子类脂以脂质体的形式用于基因转移,具有无免疫原性、易生产、质粒免受核酸酶降解和无致瘤性等优点,并且作为病毒载体的有效替代物,阳离子脂质体能用于细胞的体内和体外转染。目的:介绍阳离子脂质体介导的基因转移机制研究进展。方法:由第一作者用计算机检索中国期刊全文数据库(CNKI:1987/2010)和PubMed(1987/2010)数据库,检索词分别为"基因治疗、阳离子脂质体、基因转移、机制"和"gene therapy,cationic liposome,gene transfer,mechanism",语言分别设定为中文和英文。从阳离子脂质体基因转染和基因转移机制进行总结,综述了阳离子脂质体介导的基因转移机制。结果与结论:共检索到108篇,按纳入和排除标准对文献进行筛选,共纳入20篇文章。综述了阳离子脂质体介导的基因转移机制,包括阳离子脂质体/DNA复合物的形成、细胞吸收、内含体释放和复合物解体以及细胞核摄入等方面的研究内容。结果提示,对类脂构效关系和基因转移机制的研究,是提高阳离子脂质体转染效率和优化基因治疗的关键。

超声微泡促进肿瘤细胞报告基因转染

目的 探讨超声破坏微泡造影剂后对β-半乳糖苷酶报告基因在人肝癌细胞(QGY)中转染的影响。方法 将培养QGY细胞转于2 4孔培养板后,分为5组,分别为单纯加入质粒组(D) ;质粒+微泡组(D +M) ;质粒+超声组(D +U) ;质粒+超声+微泡组(D +U +M) ;脂质体+质粒组(L +D) ;进行β-半乳糖苷酶质粒DNA的转染。2d后,进行β-半乳糖苷酶染色,测定各组细胞转染率。结果 单纯质粒组细胞转染率为4.92 % ;质粒+微泡组转染率为6 742 % ;质粒+超声组转染率为2 9.73 % ;质粒+超声+微泡组转染率为5 0 .88% ;脂质体+质粒组转染率为12 .15 % ;结论 超声破坏微泡造影剂可促进报告基因β-半乳糖苷酶质粒在QGY细胞的转染,为肿瘤基因治疗提供一种新型基因转移系统。

物理因子在基因转染中的作用

基因转染是实现基因治疗的前提条件,也是分子生物学领域中一项重要技术。目前常用病毒转染方法缺乏靶向性,体内导入效率低,且存在安全隐患。非病毒载体中常用的脂质体体内导入除局部注入外,并无靶向性,即使直接注入,其效率仍然不高。寻找高效、安全的基因转染方法一直是基因治疗的热点问题。近年来,物理因子介导基因转移日益引起广大分子生物学家们的广泛关注。综述和探讨物理因子在基因转染中的作用必将为寻找新型基因转染方法,提高目前基因转染的效率和拓展物理因子的应用领域提供新的思路。

三种阳离子脂质体介导血管内皮细胞基因转染效率的比较

目的:评价不同阳离子脂质体介导基因转染血管内皮细胞的转染效率。方法:实验于2006-12/2007-02在中山大学生化实验室及广州市创伤外科研究所完成。采用增强型绿色荧光蛋白基因为报告基因,分别采用Lipofectin、Lipofectamine、Dosper3种不同的阳离子脂质体为载体,转染人脐静脉血管内皮细胞。在24孔板中,每孔加入人脐静脉血管内皮细胞悬液(1×106个细胞),各孔分别加入3种不同阳离子脂质体增强型绿色荧光蛋白质粒复合物,分别于培养24,48h后用荧光显微镜及流式细胞仪测定增强型绿色荧光蛋白在细胞内的表达及转染效率。结果:3种不同阳离子介导的增强型绿色荧光蛋白基因转染的人脐静脉血管内皮细胞内均有绿色荧光蛋白表达,24h后明显,48h后达高峰。Dosper介导组绿色荧光细胞百分比明显高于Lipofectin介导组及Lipofectamine介导组,差异有非常显著意义(P<0.01)。结论:Dosper介导的血管内皮细胞基因转染效率较高,较适合作为血管内皮细胞的基因转染载体。

gax基因转染对血管平滑肌细胞中基质金属蛋白酶2和骨桥蛋白转录的影响

目的:探讨腺病毒介导gax基因转染血管平滑肌细胞(VSMC)后,VSMC中基质金属蛋白酶2(MMP2)和骨桥蛋白基因转录的变化。方法:以携带大鼠gax基因表达序列的复制缺陷型5型腺病毒载体(AdCMV-gax)转染VSMC后,应用免疫细胞化学染色检NGax蛋白表达的变化,以RT-PCR技术检测VSMC中MMP2 mRNA和骨桥蛋白mRNA的变化。结果:AdCMV-gax转染后:(1)VSMC中Gax蛋白的表达比转染前显著增高(P<0.01); (2)VSMC中MMP2 mRNA和骨桥蛋白mRNA 比未转染组均显著降低(P<0.05)。结论:增强gax基因表达可抑制MMP2和骨桥蛋白的转录。

基因转染新方法——声化学基因转染

目的基因转染效率低下一直是限制基因研究与基因治疗进一步发展和广泛应用的瓶颈问题。笔者将生物技术和超声技术有机结合,提出一种基因转染新方法即声化学基因转染或声化学内在化,为提高基因转染效率提供新的思路和新手段。

受体介导的基因转移

受体介导的基因转移技术以其转移基因的相对高效性和特异性日益受到重视。本文对该技术的原理、转移基因载体的构建、提高基因转染率和表达水平的方法,以及临床应用潜力等问题进行了综述。

BRD7基因转染对鼻咽癌细胞生长的抑制作用

目的：探讨鼻咽癌负相关基因ＢＲＤ７对鼻咽癌细胞系ＨＮＥＩ生长的影响。方法：构建ＢＲＤ７基因真核表达载体ｐｃＤＮＡ３.１（＋）／ＢＲＤ７重组体，采用脂质体介导转染技术，将ＢＲＤ７真核表达重组质粒和空载体质粒分别导入鼻咽癌细胞系ＨＮＥ１，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和ＲＴ－ＰＣＲ分别检测外源性ＤＮＡ的整合和ＢＲＤ７基因的表达，并借助细胞生长曲线、软琼脂集落形成试验、流式细胞计数和裸鼠接种方法对转染细胞的生物学行为进行了检测。结果：转染ＢＲＤ７基因的 ＨＮＥ１生长倍增时间为５３ ｈ，较ＨＮＥ１（２３．９ｈ）和空载体转染 ＨＮＥ１（２４.１ｈ）明显延长，流式细胞仪表明，ＢＲＤ７表达升高延缓细胞由Ｇ０－Ｇ１期进人Ｓ期，ＢＲＤ７转染ＨＮＥ１在软琼脂中集落形成率较对照组显著下降（Ｐ＜０．０１），裸鼠接种试验显示ＢＲＤ７基因转染细胞ＨＮＥ１生长速度受到抑制。结论：ＢＲＤ７基因重表达有助于ＨＮＥ１的恶性表型的逆转；ＢＲＤ７是一个鼻咽癌相关的抑瘤基因良好的候选者。

重组PGL3-转化生长因子β_1基因转染兔骨髓基质干细胞体外诱导向软骨细胞分化的实验研究

目的探讨将编码细胞转化生长因子β1(transforminggrowthfactorβ1,TGF-β1)的重组PGL3-TGF-β1质粒转染兔骨髓基质干细胞(marrowstromalstemcells,MSCs),体外通过自分泌、诱导作用向软骨细胞方向分化的可行性,为基因加强组织工程学修复软骨损伤提供体外实验依据。方法兔MSCs体外密度梯度离心及贴壁筛选法分离培养,脂质体法转染重组PGL3-TGF-β1,转染后绘制不同时期细胞生长曲线,MTT法分析转染后细胞(实验组)生长活性,以未转染空载体细胞为实验对照组,未转染细胞为空白对照组;转染后第2、7天,分别进行抗TGF-β1和抗型胶原蛋白的免疫组织化学染色(SABC法),以未转染细胞为实验对照组,PBS作为一抗为空白对照组,进行图像定量分析。结果MSCs体外分离培养,脂质体法转染后,生长曲线显示转染后细胞生长活性较对照组降低,MTT法显示实验组及实验对照组吸光度(A)值较空白对照组低,差异有统计学意义(P<0.01);实验组转染细胞第2天,抗TGF-β1免疫组织化学染色可见细胞内阳性颗粒,实验对照组及空白对照组均为阴性;转染细胞第7天,抗型胶原免疫组织化学染色实验组可见细胞内阳性颗粒,实验对照组及空白对照组均为阴性。图像分析示,实验组抗TGF-β1及抗型胶原免疫组织化学染色阳性值与实验对照组及空白对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论脂质体法重组PGL3-TGF-β1基因可成功转染兔MSCs,但对细胞生长有一定影响,转染细胞表达TGF-β1,通过其自分泌、诱导作用,细胞分泌型胶原蛋白,表现出软骨细胞样生理特征,并向软骨细胞方向分化。

NAG7基因转染对鼻咽癌细胞生长的影响

为了探讨鼻咽癌表达下调基因NAG7对鼻咽癌细胞系HNE1生长的影响 ,构建了NAG7基因的真核表达载体pcDNA3 1(+) /NAG7,并采用脂质体转染技术将真核重组体pcDNA3 1(+) /NAG7质粒和真核空载体pcDNA3 1(+)质粒分别导入HNE1细胞 ,经G4 18筛选后获得稳定转染细胞克隆 ,RT PCR和RNA印迹检测NAG7基因的表达 ,并通过细胞生长曲线、裸鼠接种和流式细胞等方法对转染细胞的生物学行为进行检测 .结果显示 :转染NAG7基因后 ,基因表达增加 ,细胞生长倍增时间较空载体转染和HNE1明显延长 ,流式细胞技术检测表明 ,NAG7可延缓细胞由G0～G1期进入S期 ;裸鼠接种实验显示转染NAG7基因后的HNE1细胞致瘤性受到抑制 .上述结果表明 :NAG7基因转染后鼻咽癌细胞生长受到抑制 。

超声介导微泡破裂增强体外基因转染的方法学研究

目的对超声促进基因转染的方法进行系统的优化研究,初步确定超声介导微泡破裂(UMMD)增强体外基因转染的最优参数。方法选用Ishikawa、Hela和MCF-73种细胞系为研究对象,用1MHz超声仪,超声强度为1.0W/cm2,系统研究不同参数下的细胞活力及两种DNA质粒[红色荧光蛋白质粒(DsRed)和荧光素酶质粒(pCMV-LUC)]的基因转染情况,优化UMMD的转染条件(质粒浓度、占空比及辐照时间),分析SonoVue微泡对基因转染的增强作用。结果基因转染率随着质粒浓度的增加而增高,当质粒浓度达到30μg/孔时转染率最高,两种DNA质粒的最佳转染浓度相同。与10%占空比的超声辐照相比,20%占空比的转染率显著提高(P<0.01)。辐照3min时基因表达率最高,但存活率无明显下降(89.03±2.01)%,为最佳辐照时间。无超声辐照时,单独应用质粒或微泡+质粒的样本几乎不表达红色荧光蛋白。与单纯超声辐照相比,超声辐照联合SonoVue微泡可显著提高基因转染效率(P<0.01)。结论UMMD的转染参数影响转染效率和细胞活力,优化的参数有利于促进基因转染。

重组腺病毒介导IFN-γ基因转染的巨噬细胞的体外免疫效应功能分析

巨噬细胞既是免疫效应细胞又是抗原提呈细胞，为研究ＩＦＮ－γ基因转染的巨噬细胞过继回输疗法，以重组腺病毒为载体将小鼠ＩＦＮ－γｃＤＮＡ转染入小鼠腹腔巨噬细胞，观察了对其体外免疫功能的影响，结果表明，ＩＦＮ－γ基因转染１８ｈ后巨噬细胞上清中存在高水平ＩＦＮ－γ，ＩＦＮ－γ基因转染的巨噬细胞杀伤活性显著增高，其分泌ＴＮＦ、ＩＬ－１、ＮＯ的水平均有不同程度的升高，表明重组腺病毒载体能将ＩＦＮ－γ基因成功地转染入巨噬细胞并增强巨噬细胞免疫效应功能。

bFGF基因转染促进股骨头坏死修复的实验研究

目的 :为临床治疗股骨头及其它骨缺血性坏死探索新方法。方法 :将碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)真核表达质粒pCD rbFGF与胶原混合植入坏死的兔股骨头内 ,术后RT PCR及免疫组化方法检测bFGF表达情况 ,组织切片及组织形态学分析股骨头内血管生长及新骨形成情况。结果 :术后 2周RT PCR及免疫组化证实转染bFGF基因的股骨头内有bFGF表达。术后 2周股骨头内血管生长与对照组相比 ,术后 8周股骨头内新骨形成与对照组相比 ,差异均有非常显著意义 (P <0 .0 1)。结论 :利用bFGF基因转染可刺激股骨头坏死内血管再生和新骨形成 。

硅纳米颗粒作为基因转染载体的研究

通过不同浓度的NaCl、NaI修饰硅纳米颗粒 ,用琼脂糖凝胶电泳分析硅纳米颗粒与DNA结合力及对DNA的保护作用 ,同时用绿色荧光蛋白基因作报告基因 ,以硅纳米颗粒作为基因转染的载体 ,转染HT10 80细胞。经电镜观察证实硅纳米颗粒进入细胞内 ;硅纳米颗粒与DNA结合后 ,能对DNA起保护作用 ;并且硅颗粒作为基因转染的载体 ,将绿色荧光蛋白基因导入HT10 80细胞 ,用荧光显微镜观察到发绿色荧光的细胞。结果表明 。

IL－3基因转染的肿瘤细胞增强机体免疫功能的实验研究

建立了ＩＬ－３基因转染的Ｂ１６小鼠黑素瘤细胞株（Ｂ１６－ＩＬ－３），发现其体内的致瘤性和肺转移能力明显下降。对其免疫机理作一探讨。结果发现接种Ｂ１６－ＩＬ－３细胞的小鼠脾细胞体外所诱生的ＬＡＫ活性和ＣＴＬ活性显著升高，外周血和脾细胞的ＣＤ４￣＋／ＣＤ８￣＋比值都有所升高；此外，在裸鼠体内，Ｂ１６－ＩＬ－３细胞的致瘤性也有一定程度的降低。结果表明ＩＬ－３基因转染的肿瘤细胞能诱导机体的特异性和非特异性免疫功能，参与机体的抗肿瘤作用。