bFGF基因转染促进股骨头坏死修复的实验研究

目的 :为临床治疗股骨头及其它骨缺血性坏死探索新方法。方法 :将碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)真核表达质粒pCD rbFGF与胶原混合植入坏死的兔股骨头内 ,术后RT PCR及免疫组化方法检测bFGF表达情况 ,组织切片及组织形态学分析股骨头内血管生长及新骨形成情况。结果 :术后 2周RT PCR及免疫组化证实转染bFGF基因的股骨头内有bFGF表达。术后 2周股骨头内血管生长与对照组相比 ,术后 8周股骨头内新骨形成与对照组相比 ,差异均有非常显著意义 (P <0 .0 1)。结论 :利用bFGF基因转染可刺激股骨头坏死内血管再生和新骨形成 。

超声破坏微泡法介导增强型绿色荧光蛋白质粒转染兔股骨头组织的安全性及可行性(英文)

背景:超声微泡转染系统已尝试于体内多部位的基因转染,但尚未见有用于骨部位基因转染的报告。目的:观察超声破坏微泡法介导增强型绿色荧光蛋白质粒转染兔股骨头组织的效率及可行性。方法:将日本大耳白兔按随机均分为裸转染组,预照射+裸转染组,超声定位转染组,预照射+超声定位转染,重复定位转染组。其中前2组不给予超声定向转染照射,后3组利用超声微泡破裂法介导增强型绿色荧光蛋白质粒,定向基因转染兔股骨头。各组转染1周后,于荧光显微镜下观察增强型绿色荧光蛋白在股骨头组织中的表达情况。结果与结论:超声定位转染组,预照射+超声定位转染,重复定位转染组均有增强型绿色荧光蛋白表达,且复定位转染组增强型绿色荧光蛋白质粒在兔股骨头内的转染效率明显高于其他组(P<0.01)。超声定位转染组,预照射+超声定位转染,重复定位转染组兔超声照射部位软组织和骨组织切片未观察到明显损伤病灶。结果证实,超声微泡破裂法能安全、有效实现增强型绿色荧光蛋白质粒在兔股骨头组织的转染。

血管内皮生长因子基因转染促进股骨头坏死修复

目的 探索治疗股骨头及其它骨缺血性坏死新方法。方法 将血管内皮生长因子真核表达质粒pCD hVEGF1652 0 0 μg与胶原混合植入坏死的兔股骨头内 ,术后 2、4周用免疫组化SABC方法检测血管内皮生长因子 (VEGF)表达情况 ,组织形态学分析术后 2、4周修复区血管生成情况及术后 6、8周股骨头新骨形成情况。结果 术后 2周免疫组化证实基因转染组股骨头内有VEGF表达 ,组织形态学检测发现术后 2、4周转染基因的股骨头内血管生长快于对照组 ,术后 4、8周转染基因股骨头新骨形成多于对照组 ,差异均有显著性(P <0 0 1)。结论 利用VEGF基因转染刺激坏死骨组织内血管再生 ,可促进坏死骨修复 。

BMP-2基因转染的自体骨髓间充质干细胞修复羊股骨头坏死的生物力学研究

目的观察BMP-2基因转染的自体骨髓间充质干细胞(MSCs)修复羊股骨头坏死后的局部生物力学变化。方法11只羊共22侧后肢,其中3只(6侧)作为正常对照,8只(16侧)通过结扎旋股内外侧动脉和液氮灌注等方法建立股骨头无菌性坏死动物模型。8只模型羊中,3只(6侧)不处理作为空白对照;5只共10侧植入分别复合BMP-2基因或β-gal基因转染的自体MSCs的β-磷酸三钙多孔材料,其中左侧为BMP-2治疗组,右侧为β-gal对照组,植入后第16周将所有动物处死,取植入区松质骨标本和软骨下骨进行压缩试验。结果BMP-2组植入区松质骨标本的最大抗压强度为(38.35±4.16)MPa,弹性模量为(86.85±7.28)MPa;软骨下骨的最大抗压强度为(80.76±5.32)MPa,弹性模量为(126.65±10.88)MPa。这些参数均与正常骨接近,显著大于未治疗组和β-gal组(均为P<0.05)。结论BMP-2基因转染自体干细胞可促进坏死股骨头修复,改善植入区松质骨和软骨下骨的力性能,防止股骨头软骨面的塌陷。

重组PGL3-转化生长因子β_1基因转染兔骨髓基质干细胞体外诱导向软骨细胞分化的实验研究

目的探讨将编码细胞转化生长因子β1(transforminggrowthfactorβ1,TGF-β1)的重组PGL3-TGF-β1质粒转染兔骨髓基质干细胞(marrowstromalstemcells,MSCs),体外通过自分泌、诱导作用向软骨细胞方向分化的可行性,为基因加强组织工程学修复软骨损伤提供体外实验依据。方法兔MSCs体外密度梯度离心及贴壁筛选法分离培养,脂质体法转染重组PGL3-TGF-β1,转染后绘制不同时期细胞生长曲线,MTT法分析转染后细胞(实验组)生长活性,以未转染空载体细胞为实验对照组,未转染细胞为空白对照组;转染后第2、7天,分别进行抗TGF-β1和抗型胶原蛋白的免疫组织化学染色(SABC法),以未转染细胞为实验对照组,PBS作为一抗为空白对照组,进行图像定量分析。结果MSCs体外分离培养,脂质体法转染后,生长曲线显示转染后细胞生长活性较对照组降低,MTT法显示实验组及实验对照组吸光度(A)值较空白对照组低,差异有统计学意义(P<0.01);实验组转染细胞第2天,抗TGF-β1免疫组织化学染色可见细胞内阳性颗粒,实验对照组及空白对照组均为阴性;转染细胞第7天,抗型胶原免疫组织化学染色实验组可见细胞内阳性颗粒,实验对照组及空白对照组均为阴性。图像分析示,实验组抗TGF-β1及抗型胶原免疫组织化学染色阳性值与实验对照组及空白对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论脂质体法重组PGL3-TGF-β1基因可成功转染兔MSCs,但对细胞生长有一定影响,转染细胞表达TGF-β1,通过其自分泌、诱导作用,细胞分泌型胶原蛋白,表现出软骨细胞样生理特征,并向软骨细胞方向分化。

精子干细胞转染法制备转基因兔的研究

采用直接注射的方法 ,将脂质体包裹的含人乳铁蛋白基因重组质粒 pLNCXHLF注入兔睾丸组织中 ,一个月后与正常雌兔交配。所产仔兔经PCR、Southern检测证明获得了转基因兔 ,转基因阳性率平均为 35 %。实验结果表明 ,通过注射可将外源基因导入到曲细精管中 ,进而完成对精子干细胞的转染 ,获得携带外源基因的成熟精子 ,受精后可得到转基因动物。该方法是一种简捷、有效的新途径 ,既节省时间又降低了成本 ,为利用精子载体制备转基因动物的研究提供了很有价值的参考。

骨髓间充质干细胞预构人工骨对兔股骨头坏死的修复作用

目的:研究转染血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)基因的骨髓间充质干细胞(bonemesenchymalstemcells,BMSCs)对兔股骨头无菌性坏死的修复作用。方法:以脂质体介导pCDNA3-Ang-1质粒转染体外分离培养的兔BM-SCs,与磷酸三钙(TCP)陶瓷复合,修复兔液氮冷冻股骨头坏死模型。48只兔随机分为实验组和对照组,以未转染细胞组作对照,实验组植入修复材料,分别于第2,4,8,12周取材,进行X射线片、电镜、组织学及图像处理、免疫印迹等方法检测骨修复情况。结果:细胞与TCP材料复合生长良好。组织学检查见转染细胞组股骨头病变进展延缓,毛细血管生长及新骨形成活跃,电镜显示实验组成骨细胞和胶原纤维多于对照组,细胞器成熟,图像分析显示术后8,12周骨小梁体积(TBV%)由对照组34.31±8.25和34.55±9.69升至实验组38.65±9.32和39.36±8.24(t=2.29～3.18,P<0.05)。实验组截面血管密度(MVD%)在术后4,8,12周达到23.68±5.76,25.16±5.46,28.47±6.63,与对照组21.54±4.98,22.36±7.25,24.25±7.31组间差异有显著性意义(t=2.23～2.64,P<0.05)。结论:实验组较对照组血供改善,股骨头修复加强。与细胞因子局部定向释放,促进血管形成及骨代谢有关。Ang-1修饰的BMSCs预构人工骨有助于股骨头坏死的修复。

hBMP_7基因转染对兔骨髓间充质干细胞增殖及胶原合成的影响

使用含hBMP7基因的重组逆转录病毒液感染兔骨髓间充质干细胞 (BMSc) ,MTT法检测细胞增殖能力 ,流式细胞仪检测细胞周期 ,3 H脯氨酸掺入法检测Ⅰ型胶原合成和表达情况。结果显示 ,经hBMP7基因转染的BMSc与空载体转染及未转染的BMSc在细胞增殖、细胞周期表现方面无显著性差异 ,经转染的BMSc合成胶原显著高于空载体转染和未转染者。提示采用逆转录病毒介导转染BMSc后能促进细胞的胶原合成 ,对BMSc增殖和细胞周期无显著影响 。

柔红霉素联合bax基因转染对兔实验性增生性玻璃体视网膜病变的影响

目的 :观察柔红霉素 (DNR)和bax基因转染联合应用对兔实验性增生性玻璃体视网膜病变 (proliferativevitre oretinopathy ,PVR)形成的影响 .方法 :将 2 .5× 10 5个正常视网膜色素上皮 (retinalpigmentepithelial,RPE)细胞和 3.5×10 5个经bax基因转染的RPE细胞注入兔玻璃体腔 ,观察诱发兔眼PVR形成的能力 ,同时观察 10nmolDNR对PVR形成的抑制作用 .结果 :在 3,7,14 ,2 1和 2 8d时RPE组PVR的平均分级为 :0 .6 2 5 ,2 .0 0 0 ,3.0 0 0 ,4 .12 5和 4 .2 5 0 ,基因转染细胞组PVR的平均分级为 :0 .5 0 0 ,0 .875 ,2 .0 0 0 ,3.12 5和3.6 2 5 ,后者PVR分级均低于RPE细胞组 (P <0 .0 5 ) .2 8d时正常细胞组视网膜脱离发生率为 10 0 % (n =8) ,bax基因转染细胞组的视网膜脱离发生率为 6 2 .5 % (n =8) .在 7,14 ,2 1和 2 8d时 ,DNR对正常细胞组PVR的抑制率分别为6 0 % ,6 4 % ,5 7%和 5 7% ,对基因转染细胞组PVR分级的抑制率分别为 73% ,71% ,6 8%和 6 9% ,后者普遍大于前者 .结论 :DNR可以抑制PVR的形成 。

逆转录病毒介导hBMP_7基因转染兔骨髓间充质干细胞的表达

采用粘 粘端连接方法构建hBMP7逆转录病毒载体 ,重组质粒转染包装细胞PT6 7后 ,制备含目的基因的重组逆转录病毒液感染兔骨髓间充质干细胞。限制性内切酶酶切分析筛选插入方向正确的重组质粒并进行基因测序。结果显示 ,hBMP7逆转录病毒载体中外源基因插入方向正确、无碱基错误和缺失。原位杂交和免疫组织化学检测表明 ,感染后 2天经基因转染的BMSc原位杂交和免疫组化检测结果呈阳性 ,未经转染的细胞检测结果呈阴性。转染的BMSc经G4 18筛选至 4周仍有外源BMP蛋白的表达。提示采用逆转录病毒介导方法转染的BMSc中可有外源性BMP7mRNA和蛋白的表达。

转染BMP-2基因的骨髓MSC复合多孔磷酸钙骨水泥构建组织工程化骨对兔骨缺损的修复作用研究

目的研究骨髓间充质干细胞(MSC)经骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因转染后与多孔磷酸钙骨水泥(CPC)进行复合而建立组织工程化骨,分析其修复骨缺损的效果。方法取新西兰白兔32只,构建双侧股骨髁缺损的动物模型,双侧均植入骨髓MSC复合CPC组织工程化骨,其中右侧植入未转染BMP-2基因为对照组,左侧植入BMP-2基因为转染组。分别于植入后1、3个月,取两组双侧股骨髁,通过Van-Gieson染色法观察骨组织形态学变化,计算新骨形成面积在总缺损区中的占比;于植入后3个月,对两组新骨形成情况进行免疫荧光标记检测。结果植入后1个月,对照组仅于CPC外周出现少量新骨组织,转染组出现诸多新骨组织生成,以CPC外周孔隙为多见。植入后3个月,对照组植入区出现诸多新骨组织向CPC周围至中心区生长,但支架材料吸收效果并不明显;转染组人工骨内部出现诸多新骨组织生成,外周编织骨进展为成熟的小梁骨,外周区可见支架材料吸收较明显,部分被新骨组织所取代。相比植入后1个月,两组植入后3个月新骨面积在总缺损区的比率均明显提高(P <0. 01);相比对照组,转染组植入后1、3个月新骨面积在总缺损区的比率均明显提高(P <0. 01)。植入后3个月,转染组的组织工程化骨成骨速率为(5. 73±1. 24) m/d,较对照组的(3. 09±0. 98) m/d显著提高(P <0. 01)。结论通过基因转染的方法,将BMP-2基因转染至骨髓MSC,使之复合CPC材料,可明显提高新骨形成速率,从而可有效增强组织工程化骨对骨缺损的修复作用。

人凝血酶调节蛋白基因对兔动脉壁的转染

目的探讨注射加压转染的方法对兔动脉壁进行人凝血酶调节蛋白(human thrombomodulin,hTM)基因转染的可行性。方法健康新西兰大白兔84只,应用抽签法随机分为3组:pcDNA3.1/hTM质粒组(n=28),pcDNA3.1(+)/neo质粒组(n=28)和未转染组(n=28),通过基因转染并建立动脉损伤-阻滞模型,于术后3、7、14和28 d分别检测hTM mRNA和蛋白在动脉壁的表达。结果17只实验动物在手术当天至术后3 d内意外死亡。pcDNA3.1/hTM质粒组各时间点的hTM mRNA表达都明显高于pcDNA3.1(+)/neo质粒组和未转染组(P<0.01);pcDNA3.1(+)/neo质粒组和未转染组组内和组间每个时间点的hTM mRNA表达比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。hTM蛋白在各组中均有表达,主要位于动脉内腔面;pcDNA3.1/hTM质粒组各时间点的hTM蛋白表达明显高于pcDNA3.1(+)/neo质粒组和未转染组(P<0.05);pcDNA3.1(+)/neo质粒组和未转染组的hTM蛋白表达在各个时间点都相对恒定,组内和组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论用动脉腔内加压法可以有效地对活体动物的动脉壁进行基因转染。

转染外源性转化生长因子β_1基因对兔髓核细胞凋亡的影响

①目的 探讨转染转化生长因子 β1 (hTGF β1 )基因对兔髓核细胞凋亡的影响 ,为活化椎间盘细胞功能、预防椎间盘组织退变提供依据。②方法 取成年新西兰大白兔 5只 ,将外源性hTGF β1 基因直接注射于L3～ 4椎间隙 ,以注射同样剂量磷酸缓冲液的L4～ 5作为实验对照。术后 3周取出相应椎间盘组织 ,利用TUNEL免疫荧光组织化学方法观察髓核细胞凋亡情况。应用Vidas图像分析系统进行免疫阳性细胞半定量分析。③结果 注射hTGF β1 基因的椎间盘凋亡细胞数明显少于对照组 ,测得OPTDM值分别为 0 .0 0 2± 0 .0 0 1、0 .1 5 9± 0 .0 4 1 ,二者差异有显著性 (t=2 7.83,P <0 .0 1 )。④结论 转染hTGF β1

腺病毒介导hTGF-β1基因体内转染兔椎间盘髓核细胞的表达

目的 观察以腺病毒为载体的外源性治疗基因Ad CMV hTGF β1转染兔椎间盘髓核细胞后的表达。 方法 采用本实验室构建的腺病毒载体基因Ad CMV hTGF β12 0 μl(6× 10 6 pfu)注射于纯种成年新西兰大白兔腰椎间盘髓核内 ;手术后不同时间分别取出椎间盘 ,用免疫组织化学方法对椎间盘髓核细胞进行基因表达产物测定 ;用VIDAS图像分析系统进行半定量观察。 结果 免疫组织化学染色显示注射Ad CMV hTGF β1椎间盘 ,4d组可见髓核细胞内呈现阳性染色颗粒 ;1周组即显示强阳性染色 ,阳性表达持续至 12周组。实验对照组及自身椎间盘对照组呈阴性或弱阳性反应。 结论 椎间盘髓核作为靶细胞能够被外源性基因转染 ;腺病毒载体基因Ad CMV hTGF β1转染兔椎间盘髓核细胞后能在相当长时间内表达TGF

bFGF基因体外转染兔骨髓间充质干细胞及对其增殖的影响

目的:观察bFGF基因体外转染兔骨髓间充质干细胞(bMSCs)后细胞目的基因的表达及对其增殖的影响。方法:将兔骨髓来源的间充质干细胞分离培养扩增,用PCR扩增法获得绿色荧光蛋白-bFGF基因重组质粒,转染间充质干细胞,用荧光显微镜观察转染后绿色荧光蛋白基因的表达,计算转染率,用MTT检测转染细胞的增殖特性。结果:实验成功地构建了绿色荧光蛋白-bFGF基因重组质粒,倒置荧光显微镜下观察到转染后的bMSCs发出稳定的绿色荧光信号,转染率为(43.32±4.51)%,MTT法显示重组质粒组增殖速度显著高于空白质粒组和未转染细胞组(P<0.05)。结论:运用转染的方法实现了两种基因在MSCs中的共同表达,为监控MSCs细胞的转染和表达过程提供了一种手段。为后期利用MSCs细胞进行组织工程骨组织制造和移植提供了规范化的监控和程序化生产手段。

重组pEGFP/Ang-1质粒转染兔骨髓基质干细胞及其表达的实验研究

目的 制备稳定高效表达血管生成素 1(Ang 1)的转基因工程骨髓基质干细胞。 方法 应用基因重组的方法构建Ang 1真核表达质粒 pEGFP/Ang 1,利用脂质体将 pEGFP/Ang 1转入骨髓基质干细胞 ,用流式细胞仪检测转染率 ,用荧光显微镜和免疫细胞化学方法检测蛋白质的表达。结果 质粒酶切电泳显示重组质粒构建成功 ,转染pEGFP/Ang 1质粒的骨髓基质干细胞在荧光显微镜下可见绿色荧光 ;流式细胞仪检测转染率约 5 0 % ;免疫细胞化学检测可见转基因骨髓基质干细胞表达Ang 1蛋白。结论 成功制备表达外源性基因Ang 1的骨髓基质干细胞 ,制备方法是可行的。

pcDNA3.1-BMP-2真核表达载体构建及转染兔骨髓基质细胞的实验研究

目的 构建人骨形态发生蛋白2(BMP-2)真核表达载体,鉴定并转染兔骨髓基质细胞,为转基因治疗骨缺失疾病提供实验基础。方法 双酶切克隆载体将BMP-2目的基因与真核表达载体pcDNA3.1连接,免疫组化及Western blotting检测转染BMP-2基因骨髓基质细胞的表达效果。结果 成功构建BMP-2真核表达载体,转染骨髓基质细胞后,有BMP-2表达。结论 骨髓基质细胞经基因转染后可以表达BMP-2,为进一步实验研究提供基础。

phVEGF_(165)原位转染缺血肌肉后hVEGF基因及其蛋白表达

目的 :探索慢性下肢动脉缺血的基因治疗。方法 :选用VEGF作为治疗基因 ,通过建立实验兔慢性下肢动脉缺血模型 ,将构建的人VEGF165cDNA真核表达载体 phVEGF165注入缺血肌肉内 ,采用RT PCR和原位杂交法测定肌肉内hVEGF165表达 ,采用免疫组化和Western印迹法测定其蛋白产物表达。结果 :骨骼肌细胞外源性hVEGF165基因表达量于注射后 1周达到高峰 ,能持续 2～ 3周。蛋白表达于注射后 2周达到高峰 ,能维持至注射后 4周。结论 :骨骼肌细胞能摄取并表达外源性hVEGF165基因 ,并能进一步合成分泌hVEGF165蛋白。phVEGF165肌肉直接注射的作用时间有限、范围局限 ,使用安全性较高。

可溶性支架转染c-myc反义寡核苷酸预防兔静脉移植物再狭窄

目的 :探讨可溶性支架转染c myc反义寡核苷酸是否可抑制静脉移植物内膜的增殖。方法 :2 5只健康纯种新西兰大耳白兔按体重随机分为对照组 ,支架组 ,正义组 ,反义组 ,错配组 ,将颈外静脉间置于同侧颈总动脉后用可溶性支架将反义 ,正义及错配的c myc基因片段导入静脉移植物。术后 2 8d取静脉桥标本 ,测定内膜、中膜厚度。结果 :反义组静脉桥的内膜厚度为 (4 3.77± 5 .89) μm ,显著低于对照组、支架组、正义组及错配组 ((80 .0 0±1.34) μm ,(76 .0 6± 4 .2 4 ) μm ,(74 .80± 9.6 4 ) μm ,(79.6 2± 7.92 ) μm ,P <0 .0 1) ;反义组内膜与中膜比值为0 .6 8± 0 .2 0 ,明显低于对照组、支架组、正义组及错配组 (1.4 2± 0 .18,1.35± 0 .2 0 ,1.34± 0 .2 6 ,1.4 1± 0 .2 4 ,P <0 .0 1)。结论 :运用可溶性支架转染反义c

纳米局部治疗介导的P53联合Rb基因对兔VX2肝转移灶血管新生的影响及分子机制

目的本研究旨在联合P53及Rb两种抗癌基因,通过纳米基因靶向治疗技术,探索其对肝转移癌灶血管新生的影响及其分子机制。方法以超液化碘油及Pll修饰的nHAP乳剂为载体,将含有野生型P53、Rb基因的重组表达质粒经肝动脉共同或者分别转运至兔VX2肝转移癌灶局部,采用蛋白印迹法及原位共焦激光显微镜确定P53及Rb共表达蛋白在转移灶的表达。然后病理观察肿瘤组织微血管密度(MVD)变化。最后应用Realtime RT-PCR级ECL蛋白杂交技术检测CD31、CD34及VEGF的表达差异。结果CD31标记的MVD显示:与其他组相比,nanoplex-p53/lipiodol及nanoplex-(p53+Rb)/lipiodol组肿瘤MVD均降低;CD34标记的MVD显示:与其他组相比,nanoplex-Rb/lipiodol及nanoplex-(p53+Rb)/lipiodol组MVD均降低。nanoplex-p53/lipiodol及nanoplex-(p53+Rb)/lipiodol组CD31 mRNA和蛋白表达降低;nanoplexRb/lipiodol及nanoplex-(p53+Rb)/lipiodol组CD34 mRNA和蛋白表达降低;nanoplex-p53/lipiodol、nanoplex-Rb/lipiodol及nanoplex-(p53+Rb)/lipiodol组VEGF mRNA和蛋白表达降低。结论以Pll-nHAP为载体的Rb基因协同P53基因纳米靶向治疗通过降低CD31、CD34及VEGF的表达减少新生血管生成,增强其抗肿瘤效应。P53基因联合Rb基因的纳米基因靶向治疗有可能成为抑制消化道癌肝转移灶血管新生的有效治疗方法。