纳米基因载体在植物遗传转化中的应用进展

利用纳米材料构建的纳米基因载体在植物遗传转化领域具有特殊的优越性,已成功应用于多种植物的遗传转化。主要阐述了纳米基因载体的特征、分类,综述了无机纳米基因载体、天然高分子纳米基因载体、人工合成高分子纳米基因载体在植物遗传转化中的应用进展,并对纳米基因载体在植物遗传转化领域的应用前景进行了展望。

基于低分子量PEI的不同疏水链修饰的梳状低聚物基因载体

为了探究基于低分子量聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)基因载体的转染效率,通过Michael加成反应将PEI 600 Da接枝于含有疏水链的生物可降解聚酯上形成系列梳状聚合物,并将之应用于基因载体;利用核磁氢谱和凝胶渗透色谱对聚合物的化学结构与分子量进行了测定,此外,还利用凝胶电泳实验和绿色荧光蛋白实验研究了聚合物与DNA的结合能力及其复合物的转染性能。结果表明:本文方法成功合成了系列低聚物,并对DNA表现出较好的包裹能力;油酸修饰后的低聚物与DNA复合物在质量比为6.4时转染效果与PEI 25 kDa相当。可见,油酸修饰后的脂质体低聚物有作为非病毒基因载体的前景。

LGALS3BP 3’UTR荧光素酶报告基因载体构建及鉴定

目的构建LGALS3BP(lectin,galactoside-binding,soluble,3 binding protein,LGALS3BP)基因3’非编码区(3’-untranslated region,3’UTR)的野生型及突变型荧光素酶报告基因重组载体并进行鉴定,以备进一步研究miRNA对LGALS3BP基因的调控。方法Targetscan软件预测LGALS3BP 3’UTR上的miRNA结合位点;以人肝癌细胞系SMMC-7721基因组DNA为模板,进行PCR扩增,获得野生型LGALS3BP基因3’UTR片段,经双酶切将目的片段定向插入报告基因载体pGL3-Control中,将克隆好的重组载体转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞进行扩增,采用菌落PCR及测序监定重组子。设计位点突变型LGALS3BP 3’UTR扩增引物,以构建的野生型LGALS3BP 3’UTR重组质粒为模板,采用重叠PCR及定点突变PCR技术进行扩增分别构建单独位点及双位点突变型重组荧光素酶报告基因载体。结果野生型LGALS3BP 3’UTR重组质粒经菌落PCR鉴定,可见871 bp的目的基因片段,大小与预期相符;测序结果表明,插入序列与LGALS3BP 3’UTR序列完全一致且插入方向正确。Targetscan软件预测到LGALS3BP 3’UTR区有两个感兴趣的miRNA结合位点。突变型LGALS3BP 3’UTR重组质粒测序鉴定结果表明,单独位点及双位点突变型重组质粒中均成功引入结合位点突变。结论成功构建LGALS3BP的3’UTR野生型(pGL3-LGAL-W-3’UTR)、两个单独位点突变型(pGL3-LGAL-M1-3’UTR和pGL3-LGAL-M2-3’UTR)及双位点突变型(pGL3-LGAL-M-3’UTR)重组荧光素酶报告基因载体,为后续研究miRNA对LGALS3BP基因的调控奠定基础。

阳离子化白及多糖作为非病毒基因载体的初步研究

目的 构建高效低毒的非病毒基因载体,负载组成型光形态发生因子9信号复合体(CSN)的第六亚基CSN6的siRNA干扰片段,考察其对人肝癌细胞的生物学作用。方法 利用白及多糖和聚乙烯亚胺合成阳离子聚合物,其结构经红外光谱、核磁共振、Zeta电位和粒径进一步表征确证;利用其负载DNA及siRNA进行凝胶阻滞实验检测其对上述分子的结合和保护能力;利用MTT法检测其在不同细胞中的细胞毒性;利用阳离子聚合物将荧光标记的siRNA转染至人肝癌细胞中,荧光显微镜下观察;将聚合物与CSN6 siRNA干扰片段的复合物转染至人肝癌细胞,并利用Western blot法进一步对CSN6 siRNA的干扰效率进行检测;抑制CSN6基因的表达,采用MTT法和克隆形成实验对人肝癌细胞增殖作用的影响进行检测。结果红外光谱、核磁共振氢谱、Zeta电位和粒径检测结果显示,白及多糖接枝聚乙烯亚胺载体构建成功;凝胶阻滞结果显示,载体能够成功与核酸分子相结合;Western blot结果显示,将CSN6 siRNA干扰片段转染至人肝癌细胞后,能够有效下调细胞中CSN6基因的蛋白表达水平;MTT和克隆形成实验结果显示,抑制CSN6基因的表达能够抑制人肝癌细胞增殖。结论 利用白及多糖接枝聚乙烯亚胺构建了一种高效低毒的非病毒基因载体,利用其负载CSN6 siRNA干扰片段能够有效抑制人肝癌细胞的增殖作用。

用氧化铁磁性纳米颗粒作为基因载体的研究

目的:评价氧化铁磁性纳米颗粒(nanoparticles)作为基因载体的可行性。方法:应用沉淀法制成外包葡聚糖的氧化铁磁性生物纳米颗粒DextranCoatedIronOxideNanoparticlesDCIONP。用分光光度计及琼脂糖凝胶电泳分析氧化铁磁性生物纳米颗粒的DNA结合力及抵抗DNASEⅠ消化的作用。以绿色荧光蛋白基因为报道基因,进行用氧化铁磁性纳米颗粒作为基因载体的体外细胞转染实验。结果:电镜检测证实DCIONP的直径在10纳米(nanometernm)左右。在酸性条件下,这种纳米颗粒表现出DNA结合力和抵抗DNASEⅠ消化的作用从而证明DCIONP与DNA的结合是静电引力的作用。在氧化铁磁性生物纳米颗粒表面修饰阳离子聚合物多聚赖氨酸DextranCoatedIronOxideNanoparticlesmodifiedwithPolyLLysine,PLLDCIONP在中性及碱性的条件下,亦可与带阴性电荷的DNA结合及抵抗DNASEⅠ消化的作用。PLLDCIONP可作为基因载体将报道基因转染入细胞,用荧光显微镜可观察到发绿色荧光的细胞。在PLLDCIONP和质粒的质量成一定的比例时,PLLDCIONP的转染效率高于脂质体。结论:PLLDCIONP可作为DNA转移载体。

壳聚糖纳米粒作为基因载体的研究:制备,特征和对DNA的保护

目的:制备载基因壳聚糖纳米粒,研究纳米粒药剂学特征以及对DNA的保护作用.方法:复凝聚法制备纳米粒,对纳米粒的形态、粒径及分布、Zeta电位、包封率、载药量和处方影响因素进行了考察,凝胶阻滞法分析壳聚糖和pDNA的聚合方式,pDNA保护性试验考察壳聚糖纳米粒抵抗核酸酶的能力.结果:制备的pDNA/壳聚糖纳米粒为结构较紧密的不规则球形,平均粒径为(240.4±13.2)nm,多分散指数为(0.173±0.05),Zeta电位为(18.4±0.6)mV,包封率为(95.2±1.9)%,载药量为(30.7±0.8)%.凝胶阻滞分析结果表明,纳米粒荷正电,pDNA与壳聚糖之间通过静电作用而完全结合.纳米粒的粒径、Zeta电位受处方中的壳聚糖相对分子质量、N/P(壳聚糖中伯胺基数目/pDNA中磷酸基数目)比、pDNA浓度、Na2SO4浓度和pH值等因素影响.pDNA保护性试验表明,壳聚糖纳米粒对pDNA有保护作用.结论:壳聚糖可以有效凝聚pDNA,采用复凝聚法可制得200～500 nm范围荷正电的纳米粒,有较高的包封率和载药量,可有效保护pDNA免受核酸酶降解.壳聚糖作为黏膜给药的非病毒基因载体具有应用价值.

一种新型纳米基因载体的制备及体外实验

本实验以聚乳酸和O 羧甲基壳聚糖为基质材料 ,采用超声波法制备了聚乳酸 O 羧甲基壳聚糖纳米微球 ,并用环境扫描电镜和XPS对其进行了表征。将聚乳酸 O 羧甲基壳聚糖纳米微球携带寡核苷酸转染TJ90 5人脑胶质瘤细胞 ,并通过RT PCR方法对细胞的转染情况作了一系列的体外检测。结果表明 ,携带寡核苷酸的聚乳酸 O 羧甲基壳聚糖纳米微球能有效地转染TJ90 5人脑胶质瘤细胞 ,同时也能有效地抑制胶质瘤细胞中端粒酶RNA、端粒酶催化亚基RNA的表达和端粒酶的活性 ,从而抑制人脑胶质瘤细胞生长 ,达到基因治疗的目的。

中药白芨提取物作为基因载体的制备与表征

目的分离纯化并制备阳离子型白芨多糖,研究其表征,探讨其作为基因载体的可能性。方法经热水抽提,乙醇沉淀,Sevag法脱蛋白,阴离子交换纤维素柱(DE-52)和凝胶柱(Sephadex G-100)色谱,分离纯化得白芨多糖,通过高碘酸钾氧化得到含醛基的还原性多糖,该还原性多糖与精胺在碱性条件下形成希夫碱式共轭物,经硼氢化钠还原得含伯胺基的阳离子型多糖,分别通过盐酸羟胺法和三硝基苯磺酸法测醛基与伯胺基的产量,并考察了氧化反应时间对反应产物的影响。进一步通过琼脂糖凝胶电泳检测该阳离子型多糖对基因的结合与保护作用。结果所提纯的白芨多糖为一种不含阳离子基团的非还原性多糖,通过胺化还原反应的方法可成功制备出含伯胺基的阳离子型多糖,红外光谱证实了多糖上伯胺基的存在,进一步的研究表明,该阳离子型多糖可以结合并保护质粒DNA。结论通过胺化还原反应方法制备的阳离子型白芨多糖,有望作为一种多糖基的多聚阳离子型基因载体在真核细胞基因转染中发挥作用。

电击法磁性纳米颗粒作为水稻转基因载体的研究

建立了以磁性纳米颗粒为载体,由电击法介导基因导入植物细胞的优化方法。制备了粒径小于10nm的磁性纳米颗粒,与绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因融合制备基因载体,同时,制备水稻悬浮细胞,加入电极杯中,调节电击条件为:电压分别是800,1000和1200V,电容25μF,电阻200Ω,直径10mm,电击数次。利用倒置荧光显微镜观察转化后的悬浮细胞,可以明显看到绿色荧光蛋白在水稻细胞内表达。说明纳米颗粒基因载体在电击作用下能有效进入细胞,利用磁性纳米颗粒作为基因载体电击法转化植物细胞初步成功。

超顺磁性葡聚糖氧化铁纳米颗粒的制备及其作为基因载体的可行性研究

背景与目的:磁性纳米颗粒作为基因载体在肿瘤基因治疗中的应用得到了迅速发展。为了能获得驱动目的基因高效稳定表达、安全无害、靶向性高、简便的新型非病毒型基因导入和治疗系统,本研究探讨超顺磁性葡聚糖氧化铁纳米颗粒(superparamagneticdextranironoxidenanoparticles,SDION)的制备及其作为体外基因载体的可行性。方法:采用化学共沉淀法制作SDION,通过丙烯葡聚糖凝胶S-300HR色谱和离心法分离SDION,用透射电镜、粒度分析仪和磁力计对SDION进行分析。以绿色荧光蛋白(GFP-C2)质粒为靶基因,通过氧化还原法构建SDION-GFP-C2复合物,用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测两者的结合率。以脂质体转染作为对照,荧光显微镜分别观察SDION和脂质体体外转染GFP-C2入膀胱癌细胞BIU-87的转染效率。结果:SDION直径在3～8nm之间,有效粒径为59.2nm,比饱和磁化强度为0.23emu/g。分别经10mmol/L的高碘酸钠氧化、0.5mol/L的硼氢化钠还原作用后的SDION和GFP的结合比例最大,SDION对GFPDNA的转染效率为45%左右,明显高于脂质体的转染效率(30%左右)。结论:SDION可通过氧化还原反应与GFP质粒相连,在体外可将GFP基因成功转染入人膀胱癌BIU-87细胞。

新型纳米基因载体(PEI/Mn_(0.5)Zn_(0.5)Fe_2O_4)的制备、表征及体外实验

采用改良的化学共沉淀法制备锰锌铁氧体磁性纳米粒子,聚乙烯亚胺(PEI)对其进行表面修饰。利用XRD、EDS、TEM、SEM、FTIR、XPS、UV-vis、Ze-ta电位仪、电泳仪、荧光显微镜等手段对其形貌、物象、成份、表面包覆功能团、元素组成、表面电位、磁响应性、DNA结合保护、体外释放及转染能力进行表征。体外加热实验验证其升温恒温能力。XRD及EDS确认已成功制备锰锌铁氧体磁性纳米粒子。修饰后的磁性纳米粒子具有良好的分散性、磁响应性及升温恒温能力。红外光谱及XPS分析验证了PEI在磁性纳米粒子表面的吸附。修饰后磁性纳米粒子的等电点由pH=7.0移至pH=11.0。具有良好的DNA结合保护转染能力。有利于其在生物医学领域的应用。

两种阳离子纳米基因载体及植物基因介导效果的研究

以阳离子聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)和壳聚糖(chitosan,CS)作为两种植物基因载体,分别制备了载基因PEI纳米粒(PEI/DNA)和壳聚糖-DNA纳米粒(CS/DNA),并对其形态、粒度分布、包封率、DNA结合的稳定性及纳米颗粒对DNA的保护等方面进行表征。并以GFP基因为报告基因进行植物细胞转染,比较两者转化效率。结果表明PEI/DNA纳米粒稳定性,对DNA的保护以及转染效率等方面均优于壳聚糖-DNA纳米粒。

纳米基因载体在植物遗传转化中的应用

纳米基因载体已成功地应用于生物医学领域并显示了优越的转染效率、良好的生物相容性和有效的基因保护作用。近年来,纳米颗粒作为基因载体在植物转导中的应用潜力越来越受到关注,也为植物遗传工程提供了新的可能性。在阐述纳米载体的特性、在植物细胞中的转导机制及转导优势的基础上,重点讨论了纳米载体在植物转基因中的应用,并对其前景进行了展望。

适配子修饰靶向PLGA纳米基因载体的构建

化学合成了功能性三嵌段复合物乳酸乙醇酸共聚物-聚乙二醇-适配子(PLGA-PEG-Apt)。使用双乳化挥发法制备包裹DNA片段的PLGA-PEG-Apt新型纳米基因药物载体,表征检测显示:制备的纳米基因载体粒径为(225.2±8.1)nm,Zeta电位约(-35.5±-3.3)mV。扫描电子显微镜下纳米颗粒形态呈圆形,表面光滑,粒径分布较均匀。纳米粒子对TFO的包封率为(25.4±3.1)%(n=3),载药量为(1.34±0.16)μg/mg。体外释放实验研究结果显示持续释放过程达23 d,且PLGA-PEG-Apt纳米粒子呈突释之后的持续缓释过程。细胞水平实验结果显示,A10适配子修饰的纳米基因载体能更多进入靶向的前列腺癌细胞株,进而发挥其抗前列腺癌增殖的作用。该研究成功制备了靶向PLGA纳米基因载体,结果满意。

自组装共混制备PEG化基因载体

通过含PEG链段的两亲聚合物的自组装共混,制备了基于疏水作用力的新型PEG化非病毒基因载体.分别选用胆固醇-聚乙二醇和聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇作为共混改性剂,研究两亲聚合物的种类对组装体在生理盐溶液中的稳定性及基因转染效率的影响.结果表明,疏水驱动力的大小是获得稳定的PEG化基因超分子组装体的关键.通过对两亲聚合物中疏水链段的选择调控,可制备稳定的PEG化基因超分子组装体,提高基因传递体系在生理盐溶液中的稳定性及基因转染效率.通过自组装共混,为新型PEG化基因超分子组装体的制备提供了切实可行的新方法.

可生物降解材料作为基因载体的研究

研究可生物降解聚合物作为控制释放的基因载体。合成聚乳酸-聚乙二醇二元共聚物（Poly（Dl-lactic acid）-co—poly（ethylene glycol，PELA）及聚乳酸-聚乙二醇-聚乙醇酸三元无规共聚物（Poly（lactic acid）-co—poly（ethylene glycol）-co—poly（glycolic acid）random copolymer，PLGAE），包裹质粒pCH110。探讨了PELA和PLGAE作为基因载体包裹DNA的各种影响因素，这两种控制释放体系的体外降解及释放行为以及对它们的细胞毒性及体外转染效率进行了测定。制备的PELA微球平均粒径1～3μm，包裹效率为62％。PLGAE微球平均粒径0．72μm，包裹效率为70％。采用包裹了质粒pCH110的微球对COS-1细胞的细胞毒性及转染实验中得出：二者的细胞毒性较小，PELA和PLGAE的转染效率均较高，且能持续表达96h，其中PLGAE的缓释效果更明显。可生物降解聚合物材料作为基因载体具有较强的优越性。

壳聚糖纳米颗粒作为基因载体的初步研究

目的：采用适当粒径大小的壳聚糖纳米颗粒（CS-NP）连接质粒DNA，观察CS-NP结合DNA的能力及介导基因转染的效率。方法：利用静电吸附作用连接CS-NP与报告基因pEGFP—N1，形成pEGFP-N1-CS-NP复合物。用透射电镜及激光粒度分析仪观察pEGFP-N1-CS—NP的形态、粒径大小、分布及Zeta电位。用琼脂糖凝胶电泳分析CS-NP与DNA结合能力，以比色法检测其包封率；用DNase I消化实验观察pEGFP-N1-CS-NP抗核酸酶降解的能力。体外转染A549细胞观察pEGFP-N1-CS-NP的转染活性。结果：激光粒度分析仪及透射电镜观察到pEGFP-N1-CS-NP呈较均匀的不规则球形，平均粒径约为100～200nm，Ztea电位为16—22．8mV。WCS-NP／WDNA≥4时，能有效地结合DNA，包封率〉90％。CS-NP能有效介导pEGFP-N1转染A549细胞，并在A549细胞中表达绿色荧光蛋白。结论：CS-NP能有效地与质粒连接，并有很高的包封率，能保护DNA免受核酸酶的降解。CS-NP在体外能将报告基因转染入细胞内，并在细胞内表达。这些研究结果为采用CS-NP作为基因载体应用于活细胞及活体成像的研究奠定了基础。

壳聚糖基因载体增强CpG-ODN免疫活性研究

目的应用壳聚糖(CS)包载含CpG序列的寡脱氧核苷酸(ODN),制备CS CpG-ODN基因载体,并研究其免疫活性。方法采用复凝法制备CS Cp-ODN基因载体。24只小鼠随机分为4组,每组6只,包括对照组、CS组、CpG-ODN组和CS CpG-ODN组,均通过后大腿肌内注射进行免疫接种。用MTT法检测淋巴细胞增殖情况,ELISA方法检测血清中IgG、IL-2和IL-12水平,流式细胞仪检测外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群。结果免疫接种CS CpG-ODN能提高小鼠淋巴细胞增殖水平;血清中IL-2和IL-12的含量明显升高,能获得高水平的保护性IgG;同时外周血T细胞亚群分析显示,CS CpG-ODN能更有效上调CD4+T细胞百分比以及CD4+/CD8+比值。结论CS CpG-ODN基因载体能有效提高CpG-ODN免疫促进作用。

叶酸靶向PEG-PEI-Alg-氧化铁磁性纳米基因载体的构建及鉴定

目的构建叶酸(folic acid,FA)分子靶向磁性纳米载体,表征其基本理化性质,分析与基因的结合能力。方法将化学共沉淀法制备的醛基化海藻酸钠(Alg)改性的Fe3O4纳米与酰胺化反应制备的聚乙二醇(PEG)-聚乙烯亚胺(PEI)-FA化合物充分混合形成PEG-PE(I-FA)-Alg-Fe3O4纳米,使用透射电镜、激光粒度检测仪、磁强计、紫外分光光谱等检测该纳米形态、粒径及Zeta电位、磁饱和强度、FA成分等;采用琼脂糖凝胶电泳分析该纳米结合基因能力。结果该纳米分散均匀,平均水动力学粒径197.8 nm,Zeta电位+12.6 mV。具有超顺磁性。紫外分光光谱检测显示成功偶联FA分子。凝胶电泳结果显示纳米粒能有效结合质粒。结论该纳米颗粒能够携带基因,可用于磁靶向及分子靶向治疗实验。

普鲁兰多糖为骨架的新型阳离子非病毒基因载体

通过琥珀酸酐将低分子量支化聚乙烯亚胺(PEI,分子量1000)偶联到普鲁兰多糖(Pullulan)上,合成了新型基因载体P-PEI.利用1H NMR、FTIR、粒度仪、Zeta电位仪、透射电镜和凝胶电泳对聚阳离子载体及其与质粒pDNA的复合物进行了表征.凝胶阻滞实验结果证明,载体P-PEI在体外可以通过静电相互作用稳定结合pDNA,并能有效抑制DNA水解酶及血清成分对pDNA的降解.噻唑蓝(MTT)细胞毒性测试、绿色荧光蛋白表达质粒(pGFP)及荧光素酶表达质粒(pGL3)转染实验结果表明,载体P-PEI在N/P高达12.5时对细胞MCF-7,HeLa和COS-7的毒性低于PEI;当N/P为6.25时能有效将pGFP和pGL3带入Hela细胞并表达,最佳转染效率及荧光素酶活分别为[(36.67±0.25)%和(28.73±7.19)×108RLU/mg蛋白,RLU为光强度],比Lipo 2000[(49.13±0.61)%,(58.47±7.62)×108 RLU/mg蛋白)略低.因此以Pullulan为骨架材料的P-PEI是一种新的有潜在应用价值的非病毒基因载体.