基于科学探究的“基因酶切与电泳实验”教学设计

在基因酶切与电泳检测实验的教学设计和实践中,将复杂的电泳技术原理和高中已学的纸层析法进行类比迁移教学,可顺利突破教学难点。在这一实验操作过程中,学生能直观地观察酶切和电泳的过程,可亲身进行分子生物学相关实验技术的操作,既能提高获取信息、联系知识的能力,又能提升自身核心素养。

限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选检测KRAS基因第12位稀有突变

目的研究限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选检测KRAS基因第12位密码子稀有突变的可行性。方法将采用限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选检测方法作为实验组,限制性内切酶酶切联合蓝白斑筛选检测方法作为对照组。对照组将KRAS基因第12位密码子突变型(MUT)/野生型(WT)(MUT/WT 12)质粒按0∶1、1∶300、1∶1000、1∶3000的比例混合,限制性内切酶酶切PCR产物,酶切后产物进行蓝白斑筛选。实验组将MUT/WT 12质粒按0∶1、1∶3000、1∶10000、1∶30000的比例混合,在对照组方法的基础上酶切产物去磷酸化后再蓝白斑筛选。比较两组蓝白斑克隆数。限制性内切酶酶切鉴定实验组MUT/WT 12为1∶30000的阳性克隆,一代测序阳性克隆验证插入片段的序列。采用限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选验证26例肺癌病例游离DNA的KRAS基因第12位稀有突变。结果对照组1∶3000的培养皿上白色克隆17个,蓝色克隆2329个,白色/蓝色克隆为1/137;而实验组1∶30000的培养皿上白色克隆23个,蓝色克隆394个,白色/蓝色克隆为1/17,1∶30000实验组白色/蓝色克隆比例明显高于1∶3000对照组。实验组1∶30000培养血上5个阳性克隆酶切鉴定出3个阳性,其插入片段为KRAS第12位突变片段。限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选26例肺癌病例可检测出2例为KRAS基因第12位密码子突变。结论采用限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选可检测出1∶30000 KRAS基因稀有突变。

高温纤维素降解菌的筛选及内切酶基因的克隆表达

以滤纸条作为唯一碳源从以牛粪和砻糠为原料的堆肥样品中分离到了8株具有纤维素降解特性的微生物,其中菌株T1和T2在刚果红培养基上培养48 h后的水解圈明显大于其他菌株。对菌株T1和T2进行了生理生化和16S rRNA序列分析,克隆了菌株T2的内切酶基因并对该基因进行了结构域分析,同时构建了表达载体p28-egB并将其转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中进行表达。研究结果表明:(1)菌株T1和T2可分别鉴定为Bacillus cereus和Bacillus subtilis;(2)菌株T2的内切酶基因片段大小为1500 bp,编码499个氨基酸,结构域分析显示该酶由两个不连续的结构域组成,其一为N端催化结构域,由糖基水解酶家族5组成,其二为C端底物结合结构域,由碳水化合物绑定结构域家族3组成;(3)在E.coli BL21中成功表达了菌株T2的内切酶基因,SDS-PAGE电泳图谱显示该蛋白大小约为50 KD,浓度约为93.14 mg·L-1。

HCV NS5b套式PCR在酶切基因分型研究中的应用

目的 :探讨HCVNS5b区酶切分型技术在临床上的应用。方法 :选用了HpaⅡ、Cfr10Ⅰ、AluⅠ、HhaⅠ、HaeⅢ、ApaⅠ、AvaⅡ、TaqⅠ、BstNⅠ、Sau 3AⅠ、StuⅠ、BalⅠ、SmaⅠ等 13种限制性内切酶 ,对已知2 3例 1b型和 17例 2a型样品进行酶切分析和验证。结果 :40例NS5b分型结果表明 2 3例 1b型中有AluⅠ特异切点 ,无 1a的BalⅠ切点和 2b的MboⅠ切点 ,17例 2a型中无A1uⅠ切点和 1a的BalⅠ及 2b的MboⅠ切点。StuⅠ可用于 1b型中基因变异诊断。结论 :HCVNS5b分型结果提示应用该分型技术 ,不仅达到了基因分型效果 ,而且还可检测基因变异 ,证实了我国存在着 1b和

基于酶切的简化基因组测序在水禽品种进化关系研究中的应用

以基于酶切的简化基因组测序技术对5个鹅品种[狮头鹅(ST)、溆浦鹅(XP)、皖西白鹅(WX)、豁眼鹅(HY)、朗德鹅(LD)]进行测定,通过序列比较发现品种间存在SNP,在分析品种群体遗传参数的基础上,建立系统发生树。研究结果表明,所有样本酶切位点在20万左右,测序覆盖度在10%以上。狮头鹅群体平均突变位点26 172个,溆浦鹅群体34 153个,皖西白鹅群体35 179个,豁眼鹅群体为29 182个,朗德鹅群体18 675个。朗德鹅与其他鹅品种的Fst均在0.08以上,说明朗德鹅和其他鹅品种序列差异较大,狮头鹅与其他3个白鹅品种之间的Fst在0.04左右,3个白鹅品种的Fst较小。系统发生树分析表明,5个鹅品种大致分为三大类,溆浦鹅和狮头鹅聚为一类,皖西白鹅和豁眼鹅聚为一类,朗德鹅单独为一类。品种之间存在大量的SNP,该研究为鹅品种识别和进化提供依据。

节瓜抗镰刀菌酸突变体内切几丁质酶基因的克隆与植物表达载体构建

根据节瓜与枯萎病菌互作构建抑制消减文库获得的内切几丁质酶基因EST序列,以节瓜抗镰刀菌酸突变体＂LT3＂为试材,通过RT-PCR与RACE相结合的方法,获得了该基因全长c DNA序列,命名为Cq Chi I。序列测定和生物信息学分析结果表明,该基因c DNA序列全长1 139 bp,编码区在38~982 bp之间,编码314个氨基酸,蛋白质分子量为33.94 ku,等电点为8.43,具有chitinase_gluco_hydro_19及lysozome_like superfamily功能域,推测该蛋白可能兼具几丁质酶与溶菌酶活性。结构分析表明,该蛋白二级结构中α螺旋、延伸链、β转角与无规则卷曲分别占24.20%、18.15%、7.96%和49.68%,该蛋白为亲水性非跨膜蛋白,1~23氨基酸预测为信号肽。其三级结构高度保守,为class I碱性几丁质酶,属于几丁质酶第19家族,为分泌细胞外蛋白。序列比对与系统进化分析结果显示,Cq Chi I与黄瓜、甜瓜、葫芦、苦瓜等植物几丁质酶基因亲缘关系紧密,与黄瓜碱性内切几丁质酶（XP004134833）相似性最高为85%。进一步构建了植物表达载体p Cambia1300并转化农杆菌EHA105,通过蘸花法转化拟南芥,为后续开展基因功能研究奠定基础。

新疆雪莲新的内切几丁质酶类冷诱导基因的分离、克隆和测序

通过RT-PCR技术,从经低温驯化的新疆雪莲的叶片中分离克隆了1个新的基因。实验证明,此基因的转录是由低温诱导激活,且随着雪莲低温驯化时间的推移,转录本的量明显增加。测序结果显示,此基因全长643bp,编码200个氨基酸。序列分析发现,此基因属于Ⅱ类内切几丁质酶基因。初步预测此基因的编码产物可能具有抗冻活性。

Aspergillus ficuum内切菊粉酶基因在大肠杆菌中表达

研究内切菊粉酶基因在大肠杆菌中表达,利用基因工程的原理和方法,将来源于Asper-gillus ficuum JNSP5-06的内切菊粉酶基因(endoI)克隆到pET-28a(+),并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。重组菌经IPTG诱导后对表达产物进行酶活检测和酶水解产物分析。结果表明已成功构建表达载体pET28a-endoI,表达后的粗酶活为35 U/mL发酵液;重组酶水解菊粉的产物经TLC分析证实酶液具有内切菊粉酶活性,水解产物主要为低聚二糖、三糖和四糖。为其应用和工业化生产奠定基础。

烟草靶斑病菌内切多聚半乳糖醛酸酶基因endoPGs的克隆及表达特征分析

【目的】内切多聚半乳糖醛酸酶(endo polygalacturonases,endoPGs)是重要的致病因子之一。论文从烟草靶斑病菌(Rhizoctonia solani)强致病力菌株YC-9和弱致病菌株LF-2中克隆该致病基因,分析比较该基因的序列特征、进化关系和表达特性,研究其在与烟草互作过程的致病作用。【方法】通过比较GenBank中不同植物病原真菌的endoPGs序列设计简并引物,首先获得菌株YC-9及LF-2的endoPGs基因片段,再采用RACE技术克隆获得其cDNA全长序列;生物信息学分析比较其保守结构域及序列特征;采用MEGA 4.0软件构建endoPGs的系统进化树;通过real-time RT-PCR技术对强致病力菌株YC-9及弱致病力菌株LF-2的endoPGs与烟草K326互作的表达特性进行研究。【结果】克隆获得了烟草靶斑病菌强致病力菌株YC-9和弱致病力菌株LF-2的endoPGs的cDNA全长序列,分别命名为endoPG1和endoPG2,开放阅读框(ORF)长度均为1 086 bp,编码361个氨基酸;比较分析表明endoPG1和endoPG2的推测蛋白均具有PLNO3003基因家族保守结构域,其跨膜结构间存在差异;成功构建了该基因系统进化树,结果表明来自烟草靶斑病菌的endoPGs构成独立分支,且烟草靶斑病菌endoPG1及endoPG2同源关系最近;real-time RT-PCR表达特性分析结果显示,靶斑病菌endoPG1和endoPG2与烟草互作(接种)之后该基因的表达与未互作(不接种)的对照样品相比均呈明显上调趋势,同时endoPG1表达迅速且高于endoPG2。【结论】烟草靶斑病菌强致病力菌株YC-9及弱致病力菌株LF-2的内切多聚半乳糖醛酸酶基因均具有PLNO3003基因家族的保守结构域,其推测蛋白的跨膜结构间存在差异,该推测蛋白与烟草靶斑病菌同源关系最近,且endoPG1和endoPG2的推测蛋白的同源性最高;内切多聚半乳糖醛酸酶基因的表达受与烟草互作的诱导,在不同致病力菌株中存在明显差异。

斜纹夜蛾核多角体病毒郴州株的形态学、基因组酶切图谱及生物活性测定

对斜纹夜蛾核多角体病毒(SpliNPV)郴州株的多角体形态进行了扫描电镜观察,多角体直径在1.5～2.5μm之间;多角体经切片后透射电镜观察,每个病毒囊膜内包被的核衣壳数为2～7个;提取SpliNPV郴州株和广州株的基因组进行限制性内切酶分析,两者的图谱比较近似;分别以不同浓度的两株SpliNPV病毒悬液感染3龄初斜纹夜蛾幼虫,其半致死浓度分别为1.8×106 OBs/mL和4.2×106 OBs/mL,两者在统计学上没有显著差异。

红曲霉过表达orf5基因对洛伐他汀含量的影响

为研究红曲霉过表达orf5基因对洛伐他汀含量的影响,丰富洛伐他汀代谢调控机制。用ATMT和REMI法将gus-orf5融合基因转化红曲霉,并对ATMT法的共培养条件和REMI法的内切酶进行优化筛选,对获得的潮霉素抗性菌株进行GUS染色和PCR鉴定,并检测阳性菌株的洛伐他汀含量变化。结果筛选出20μg/mL潮霉素的培养基作为转基因红曲霉的抗性筛选浓度,补充1/10 LB的Co-IM共培养基有利于ATMT法转化,在REMI法中Xba I介导的转化效果较好。用ATMT和REMI法均获得抗性菌落,经PCR检测表明orf5和hyg基因均已导入红曲霉,GUS染色呈蓝色。过表达菌株的洛伐他汀含量比对照明显提高,高达36.89%。红曲霉过表达orf5有利于增加洛伐他汀的积累,为深入研究红曲霉orf5基因的功能提供参考。

害虫遗传不育技术中致死基因的研究与应用

基于遗传修饰手段的昆虫不育技术(SIT)作为一类物种特异、环境友好、科学高效的新兴策略,在害虫防治中具有广阔的应用前景。释放携带显性致死基因昆虫的技术(RIDL)是改进传统SIT的重要手段之一,主要包括四环素调控系统、特异性启动子、性别特异剪接系统和特异性致死基因等重要元件,其中根据不同昆虫的特点选择合适的特异性致死基因对于构建遗传不育品系至关重要。这些致死基因或受到阻遏调控系统的控制、或特异的在雌虫中表达、亦或直接作用于X染色体,导致后代在特定发育阶段或特定性别中条件致死。本文综述了RHG家族(reapr、hid、grim、michelob_x)细胞凋亡基因、转录激活因子t TA及Nipp1Dm、归巢内切酶基因等在害虫遗传不育技术中的研究和应用,讨论了特定致死基因的效应机理和应用特点,并对其可能的发展方向进行了展望。由于不同效应基因的致死作用和调控机理尚未完全明晰,因此深入研究特异致死基因的凋亡机制和在不同物种中的兼容作用,将为害虫遗传防控提供更多的研究思路和手段。

提高转HSA基因小鼠效率的研究

将无基因的序列CIT987SK-384D8(30号)和结构特异的内切酶基因hFEN1穴36号雪与HSA的cDNA(26号)进行混合注射来制备转HSA小鼠动物模型,旨在提高转HSA基因效率。结果表明:无基因的序列CIT987SK-384D8对HSA的整合基本无影响穴P>0.05雪,结构特异的内切酶基因hFEN1可以显著提高转HSA基因效率穴P<0.01雪。

PMP22基因重复检测及儿童CMT相关临床研究

目的：本研究旨在应用等位基因特异性 PCR-双酶切法进行 PMP22基因重复突变检测,并探讨该病的临床变异性和遗传异质性.方法：本课题研究对象来自本院2006-2008年收集的8例临床拟诊 CMT 病例,对8例研究对象进行系统临床检查,收集临床资料并采血,应用等位基因特异性 PCR-双酶切方法对患者进行 PMP22基因重复突变检测.结果：3 例患儿经等位基因特异性PCR-双酶切检测出特异性重复片段.7例CMT2、4例CMT3拟诊患儿以及8例正常对照中未检测出PMP22基因重复突变.结论：1、本课题入组的 CMT 患儿中 PMP22基因检出率为 37.5%.2、特异性 PCR-双酶切法特异性高,是目前检测 PMP22基因重复突变简便、快速、准确的方法.3、CMT 病具有高度的临床变异性和遗传异质性.

苏云金芽孢杆菌芽孢萌发相关基因gerM的克隆及功能研究

依照蜡状芽孢杆菌gerM基因的保守序列设计引物,从苏云金芽孢杆菌中扩增出640bp的DNA片段。以此为探针,从苏云金芽孢杆菌部分基因组酶切文库中成功地克隆到了一个4·5kb的DNA片段。序列分析表明,该片段包含一个完整的开放阅读框,其预测的编码产物与枯草芽孢杆菌GerM蛋白具有很高的同源性,将该基因命名为gerM。RT-PCR分析表明,gerM基因仅在芽孢形成的过程中表达。通过同源重组的策略构建了gerM基因的阻断突变株。研究表明,gerM基因的破坏影响苏云金芽孢杆菌芽孢萌发的速率和比例。

基于简化基因组测序的不同干形云南松遗传分析

【目的】研究直干形和扭干形云南松遗传差异,揭示其遗传变异特点。【方法】分别以胚乳和针叶为材料,采用简化基因组测序技术对直干形和扭干形云南松22份样本进行单核苷酸多态型(SNP)位点挖掘及遗传分析。【结果】样本间共获得772240个变异,其中SNP变异762699个,InDel变异9541个。在SNP变异中,颠换(38.28%)类型小于转换(61.72%)类型;而InDel变异中,缺失型变异与插入型变异数量大致相等。遗传差异分析结果显示:直干形云南松胚乳组(ES)、直干形云南松针叶组(NS)、扭干形云南松胚乳组(ET)和扭干形云南松针叶组(NT)中SNP位点的多态性信息含量(PIC)、基因多样性指数(N;)以及Shannon信息指数(Ⅰ)分别在0.1633~0.1837、0.2345~0.2625和0.3043~0.3448之间,云南松分析样本具有较低的遗传差异水平。直干形和扭干形云南松之间具有中度的遗传分化(F;=0.1071,F;=0.1437)和较高水平的基因流(N;=2.0839,N;=1.4893)。位于27条序列上的39个SNP位点能够很好地区分不同干形云南松。SNP注释结果表明:多向耐药性蛋白(PDR3)、乙烯响应转录因子(ERF017和RAP2)及MYB相关蛋白340(MYB340)等可能在云南松直干形和扭干形的发育中发挥着调控作用。【结论】云南松干形扭曲变异主要受遗传因素调控,但环境因素的协同作用增强了该特征的显著性。

APE1基因多态性与南通地区汉族肝癌患者TACE疗效及预后的关联研究

目的探讨脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶(APE1)基因141位点T/G、148位点T/G多态性与南通地区肝癌患者经动脉插管化学治疗栓塞术(TACE)疗效及预后的相关性。方法选择2012年1月1日至2013年12月31日在南通大学附属医院介入放射科住院的239例汉族肝癌患者,其中男性163例,女性76例;年龄24～83岁,平均年龄55.61岁。吸烟史84例,无155例;有饮酒史103例,无136例;乙型肝炎病毒感染205例,无34例;巴塞罗那临床肝癌(BCLC)分期B期194例,C期45例;甲胎蛋白(AFP)> 400 ng/mL 186例,≤400 ng/mL 53例;Child-Pugh分级A级221例,B级18例。所有患者均行TACE治疗,在治疗前采集外周静脉血。利用两对引物-聚合酶链反应(PCR-CTPP)技术进行APE1基因141、148位点基因分型。治疗后1个月均复查腹部增强CT、AFP等。随访患者TACE治疗3年生存情况。结果 TACE治疗次数≥4次137例,<4次102例。TACE临床疗效评价完全缓解11例,部分缓解104例,稳定87例,控制率为84.52%;3年随访86例生存患者,生存率为35.98%。携带APE1基因141位点T/T基因型143例,携带APE1基因141位点T/G+G/G基因型96例;携带APE1基因141位点T/T基因型患者TACE治疗有效率88.81%,携带T/G+G/G基因型有效率78.13%。携带APE1基因148位点T/T基因型128例,携带APE1基因148位点T/G+G/G基因型111例;携带APE1基因148位点T/T基因型患者TACE治疗有效率86.72%,携带T/G+G/G基因型有效率81.98%。携带APE1基因141位点T/T基因型患者TACE治疗有效率高于T/G+G/G基因型,差异有统计学意义(P <0.05)。Logistic回归分析,患者年龄、性别、吸烟史、饮酒史、有无乙型肝炎病毒感染、BCLC分期、AFP水平、Child-Pugh分级及TACE治疗次数与疗效无关,校正后仅APE1基因141位点基因型与治疗疗效有关;APE1基因148位点T/T基因型与T/G+G/G基因型患者之间TACE治疗有效率比较,差异无统计学意义(P> 0.05)。携带APE1基因141位点T/T基因型患者3年生存率41.26%,携带T/G+G/G基因型患者3年生存率28.13%;携带APE1基因148位点T/T基因型患者TACE治疗3年生存率35.16%,携带T/G+G/G基因型3年生存率36.94%。携带APE1基因141位点T/T基因型患者TACE治疗3年生存率高于T/G+G/G基因型,差异有统计学意义(P <0.05);携带APE1基因148位点T/T基因型与T/G+G/G基因型患者TACE治疗3年生存率比较,差异无统计学意义(P> 0.05)。Cox比例风险模型用于分析患者年龄、性别、吸烟史、饮酒史、有无乙型肝炎病毒感染、BCLC分期、AFP水平、Child-Pugh分级及TACE治疗次数等因素与预后的关系,将这些因素校正后,仅APE1基因141位点基因型与TACE治疗3年生存率相关。结论 APE1基因141位点多态性与南通地区汉族肝癌患者TACE疗效及预后相关,携带APE1基因141位点T/T基因型患者TACE疗效及预后优于APE1基因141位点T/G+G/G基因型;APE1基因148位点多态性与汉族肝癌患者TACE疗效及预后无显著关联。

胃癌与幽门螺杆菌cagA、hrgA基因相关性的研究

目的:探讨幽门螺杆菌(Hpylori)菌株中cagA和hrgA基因对胃癌的致病作用及其检测的意义。方法:胃癌及消化性溃疡术后切除标本,组织学检查,快速尿素酶法和PCR检测。结果:40例标本经组织学检查24例为胃腺癌,2例为胃黏膜相关淋巴样组织(MALT)瘤,14例为消化性溃疡。经快速尿素酶法检测,胃腺癌中,12例H pylori(+),消化性溃疡中,12例H pylori(+)。经PCR检测,胃腺癌中,18例hrgA(+),6例hrgA(-),20例cagA(+),4例cagA(-);消化性溃疡中,6例hrgA(+),8例hrgA(-),12例cagA(+),2例cagA(-)。结论:H pylori感染与胃癌的发生有密切关系。PCR检测较快速尿素酶法准确。检测cagA和hrgA基因对了解Hpylori菌株的致病性、估计疾病程度、了解病变预后及临床治疗都具有重要意义。

三个亨廷顿舞蹈病家系APEX基因氧化还原功能区变异检测

目的:探讨脱嘌呤/嘧啶核酸内切酶(APEX)基因氧化还原功能区变异与亨廷顿舞蹈病的关系。方法:采用单链构象多态性(SSCP)-DNA测序的方法检测3个亨廷顿舞蹈病家系中10名患者和26名家系内健康人外周血APEX基因氧化还原功能区变异。结果:所有样本APEX基因3个外显子扩增片段均未发现变异。结论:3个亨廷顿舞蹈病家系内患者中无APEX基因氧化还原功能区的变异。

脱嘌呤/嘧啶核酸内切酶基因氧化还原功能区单核苷酸多态性在散发性大肠癌中存在意义的探讨

目的 探讨脱嘌呤 /嘧啶核酸内切酶 (aprimidinic/ apurinic endonuclease/ redox factor- 1,APEX)基因氧化还原功能区单核苷酸多态性与散发性大肠癌的关系。方法 采用变性梯度凝胶电泳筛选、DNA测序的方法检测 15 0例散发性大肠癌和 14 3名健康人外周血 APEX基因氧化还原功能区的基因突变或基因多态性。结果 在散发性大肠癌 APEX基因氧化还原功能区中共检出 2个多态性位点 ,分别为 4 5 3G→T和 12 4 7A→ G。4 5 3T和 12 4 7G的基因频率分别为 1.3%和 5 .7% ;对照人群中上述两位点的基因频率分别为 1.0 5 %和 4 .5 5 % ,其基因型分布符合 Hardy- Weinberg平衡定律。散发性大肠癌和健康人群中两位点的基因频率差异无显著性。结论 APEX基因氧化还原功能区的基因多态性与散发性大肠癌的发生无关。该区多态性分布具有较明显的种族差异。