高分子载体的基因释放与组织工程

以高分子为载体释放编码蛋白质质粒DNA实现组织重建的方法是在多学科、基因治疗和组织工程概念的基础上提出的 ,其技术的核心问题是以生物可降解高分子为载体的基因缓释 ;本文将综述以高分子为载体的基因释放及其在组织工程应用的研究进展 。

采用基因释放剂对微量及陈旧标本进行直接PCR扩增

为简化ＰＣＲ方法和减少标本用量，利用基因释放剂不提取ＤＮＡ，比较了利用基因释放剂和不用基因 释放剂，对微量肝素抗凝血、微量结肠粘膜组织（置－２０℃６个月）和含有ＰＣＲ抑制剂的ＤＮＡ标本直接进 行ＰＣＲ扩增。结果，利用基因释放剂，可扩增出目的产物，不用基因释放剂，来扩增出目的产物。提示利用 基因释放剂直接进行ＰＣＲ，简单快速，不用提取ＤＮＡ，适于微量、含有ＰＣＲ抑制物的ＤＮＡ及陈旧组织标本 的检测。

基因释放剂在快速制备医学真菌DNA中的应用

目的 评价基因释放剂在快速制备医学真菌DNA中的作用和应用条件。方法 样品加入基因释放剂后分别用程序加热法、微波处理法和煮沸法处理 ,然后用 18srDNA通用引物进行PCR扩增。优化PCR扩增体系和条件。结果 3种方法均能达到实验要求 ,其中以微波处理法中的 5档火力 7min条件效果最好 ,各菌株均可被扩增出一条 482bp的DNA带。敏感性为 10 1个孢子 /ml。结论 使用基因释放剂可简便快速地从小量致病真菌样本中制备DNA 。

基因释放剂结合异源双链分析快速检测β地贫最常见的一种突变

β地贫是一种分子病理具有高度异质性的、我国南方最为常见的遗传性血液病.在已发现的23种β地贫突变中,CD41-42(-TCTT)移码突变基因频率最高(达41.6%).根据PCR原理和该突变的特点,作者设计了一对引物进行PCR特异扩增,电泳分析即可检出此种突变.并引进基因释放剂DNA模板快速制备法,从而使此技术更为简便和实用.作者运用此法检测了广东珠海地区114份β地贫样品,CD41-42突变捡出率为40.35%,并成功地应用于产前诊断中.根据实验结果,作者建议在分析未知β地贫突变时,首先采用本法先对CD41-42突变进行初筛,而将RDB和ASO技术作为补充.

用“基因释放剂”从血液及羊水细胞中提取DNA直接用于PCR扩增

报告了用“基因释放剂”从血液及羊水细胞中提取ＤＮＡ的简捷方法。少量样品（２～５μｌ血液，或０．１～１．６ｍｌ羊水）经清洗后加入基因释放剂煮沸后即可直接用于ＰＣＲ扩增。此法提取的ＤＮＡ用于α－和β－珠蛋白基因的扩增效果良好，扩增产物可直接用于限制酶消化。这一新方法可作为应用ＰＣＲ进行基因分析和产前诊断的有用工具。

基因释放剂法快速提取病原性真菌DNA直接用于PGR扩增的研究

目的：利用基因释放剂快速制备病原性真菌DNA模板,简化PCR方法和减少标本用量。方法：利用基因释放剂提取临床样品中酵母菌DNA,直接用于PCR扩增,并与常用的氯化苄提取法进行比较。结果：该方法成功用于9种临床常见致病性酵母菌PCR扩增,敏感性达10个孢子/mL。用于含菌血标本的检测,均获得满意的结果。结论：该技术检测时间短、操作简单、成本低等优点,非常适合用于临床标本中致病性酵母菌DNA模板的快速制备。

基因释放剂在制备结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶DNA模板中的应用

目的 :探讨基因释放剂的应用并为结核病DNA疫苗的研究提供靶基因。方法 :分别用基因释放剂提取法与DNA提取试剂盒提取法制备结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶DNA模板 ,采用PCR法从模板中扩增早期分泌性抗原靶 (ESAT - 6 )基因并测序证实所扩增的基因是否为目的基因。结果 :从基因释放剂提取法与DNA提取试剂盒提取法制备的DNA模板中均成功地扩增出了目的基因ESAT - 6。结论 :基因释放剂提取法制备结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶DNA模板方便、快捷 ,提高了制备DNA模板效率。

基因释放剂制备结核杆菌热休克蛋白70(hsp70)DNA模板与传统制备方法比较

目的:比较常规试剂盒和使用基因释放剂提取结核杆菌热休克蛋白70 (hsp70 )DNA模板的质量,为进一步获得目的基因优化方案。方法:提取结核杆菌DNA阶段,分别使用常规试剂盒和基因释放剂,然后采用相同的PCR方案进行扩增,溴化乙锭染色,紫外光下观察目的基因扩增效果。结果:常规试剂盒提取结核杆菌DNA ,未能扩增出相应的目的基因;而使用基因释放剂,则扩增效果良好。结论:常规试剂盒相比,基因释放剂在提取结核杆菌DNA时,能够制备良好的模板,为PCR扩增目的基因奠定基础。

基于碳水化合物的阳离子聚合物载体在基因释放中的应用

在基因治疗中,基因释放载体是不可缺少的重要组成部分。近几年来聚合物基因释放载体的研究主要旨在开发低毒或无毒的阳离子聚合物用于安全有效的基因释放。作为一类天然化合物,基于碳水化合物的阳离子聚合物载体由于其良好的生物相容性和低毒性被广泛地研究并应用于基因释放。本文阐述了聚合物基因释放的机理,并对近几年来一些典型的含碳水化合物的阳离子聚合物基因释放载体作一综述。

修复骨缺损的局部基因释放载体技术

骨骼缺损是临床上常见的问题,骨结构异常严重地影响患者的外貌、功能和心理社会行为。局部基因释放载体技术是新近开展的一种修复组织缺损的新技术。本文对该技术的发展现状及其应用于修复骨骼缺损的前景简要作一综述。

借助于病毒的基因释放系统

在过去十年中 ,基因治疗方法已经成为新治疗技术的前沿。随着人们对载体生物学及疾病分子水平机制更深刻的了解 ,载体技术的巨大发展 ,已经显著地提高了人类基因治疗领域的水平。本文将讨论基因转移载体中借助于病毒的部分 ,着重阐述了目前最新建立的病毒载体 ,包括借助于小病毒、腺病毒、逆后病毒、斑病毒和疱疹病毒的载体及其新进展。过去的研究已表明 ,除了优化转基因表达的载体 ,减少与载体相关的免疫反应及载体产物外 ,还需要建立适宜的靶细胞载体转导的载体释放方法。

促性腺激素释放激素基因及其受体基因的研究进展

作者简要介绍了促性腺激素释放激素基因及其受体基因的位置、结构、表达、调控机理,并初步探讨了这两个基因与繁殖性能的关系。

导入人组织激肽释放酶基因治疗肾血管性高血压实验研究

目的构建重组人组织激肽释放酶基因真核表达载体并研究其骨骼肌注射对高血压大鼠的降压效应。方法以pBluescripeⅡKSKLK(+)为模板用PCR扩增人组织激肽释放酶基因,将其定向克隆至pcDNA3载体上,形成重组质粒pcDNA3/KLK,并经酶切和测序鉴定。给“两肾一夹”肾性高血压大鼠的股四头肌注入1000μgpcDNA3/KLK,,随后给予100V、1Hz、40ms电刺激6次,并用RT PCR、Western杂交检测人KLKcDNA在体内的表达。尾套法测血压每周2次。结果一次肌肉注射人组织激肽释放酶cDNA可明显延缓“两肾一夹”肾性高血压大鼠的血压升高;能降低血压达8～21mmHg。局部肌肉组织的信使核糖核酸(mRNA)和KLK表达阳性。结论成功构建了pcD NA3/KLK真核表达载体,肌肉注射人组织激肽释放酶基因可引起“两肾一夹”肾性高血压大鼠血压的持续性下降,显示了人KLK基因对高血压患者降压治疗的可能性。

卵巢上皮性癌组织中人组织激肽释放酶基因14的表达

目的:检测卵巢上皮性癌组织中人组织激肽释放酶基因14(KLK14)mRNA和蛋白的表达。方法:应用RT-PCR和免疫组化SP法检测正常卵巢、良性卵巢肿瘤、交界性卵巢肿瘤和卵巢上皮性癌组织中KLK14mRNA和蛋白的表达,分析其表达与卵巢上皮性癌患者临床病理特征的关系。结果:卵巢上皮性癌组织中KLK14mRNA的相对表达量(1.36±0.24)高于正常卵巢组织(0.63±0.19)(t=8.432,P<0.001);卵巢上皮性癌组织中KLK14蛋白的阳性表达率为61.4%,与正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤和交界性卵巢肿瘤相比,差异有统计学意义(χ2=21.648,P<0.001)。KLK14蛋白的表达与卵巢上皮性癌的FIGO分期(χ2=5.759,P=0.016)、组织学分级(χ2=4.671,P=0.031)和淋巴结转移(χ2=8.254,P=0.004)相关。结论:KLK14可能参与了卵巢上皮性癌的侵袭和转移。

重组人组织激肽释放酶基因转染人脐静脉内皮细胞

目的 探讨重组人组织型激肽释放酶 (HK)基因腺相关病毒载体 (rAVV/HK)对体外培养的人脐静脉内皮细胞 (HUVECs)作用。方法 将HK基因定向克隆入腺相关病毒质粒 pAAV MCS中 ,形成重组腺相关病毒 (rAAV HK)质粒 ,经聚合酶链反应 (PCR)检测和DNA测序后 ,将rAAV HK、pAAV Helper和 pAAV RC 3种质粒通过脂质体共转染 2 93细胞 ,包装成带有HK目的基因的重组rAVV/HK ,采用 β半乳糖苷酶原位染色法测定报告基因rAVV/LacZ在HT10 80中的表达 ,间接计算病毒滴度 ,并观察转染基因在传代细胞中的表达。在相同的条件下体外分别培养HUVECs(对照组 )和rAVV/HK转染的HUVEC(HK转染组 ) 4 8h ,采用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)技术检测两组HUVECsHKmRAN的表达 ,并利用硝酸还原酶法和分光光度法分别检测两组HUVECs一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合酶 (NOS)活性。结果 rAVV/HK病毒滴度为 6 .2× 10 7个 /mL ,LacZ基因能够在第一传代和第六代HT10 80细胞内稳定持续表达。与对照组比 ,HK转染组HUVECsHKmRNA表达增加 (P <0 0 0 1) ;而且HK转染组HUVECs细胞培养液中NO的含量和NOS活性明显增高 ,P值分别 <0 0 1和 <0 0 5。结论 HK基因通过重组腺相关病毒载体可成功转染体外培养的HU VECs ,使其HKmRNA表达增加 。

牦牛生长激素释放激素基因的克隆及序列分析

本文对牦牛GHRH基因进行PCR产物T-A克隆测序。通过GenBank中的Blastn分析表明:牦牛GHRH基因与普通牛同源性为98%,与猪同源性为89%。在所测序列中共有7个变异位点,变异率为1.6%,其核酸变异类型包括转换、颠换和插入,以转换最为常见。

京海黄鸡促性腺激素释放激素受体基因密码子特性分析

为了了解鸡促性腺激素释放激素受体(gonadotropin releasing hormone receptor,GnRHR)基因的密码子特性,以便于为GnRHR基因的表达选择合适的外源表达系统,本研究使用在线工具CUSP、CHIPS及CodonW软件对鸡GnRHR基因的密码子特性进行分析,并与鸡、模式动物基因组和其他动物GnRHR基因密码子特性进行比较。结果显示,京海黄鸡GnRHR基因的ENc值较小,具有较强的密码子偏好性,且偏好以G/C结尾的密码子,GnRHR基因CDS序列中,GC含量大于AT含量;CodonW软件计算结果表明,京海黄鸡GnRHR基因密码子中,密码子GCC、ATC、CTC、CTG、CGC、CGG、AGC、TCC和GTG(RSCU>2)偏好性较强,且均以G/C结尾。对31条鸡基因分析表明鸡偏好密码子中有12种G/C结尾的密码子。与大肠杆菌、酵母菌和小鼠基因组密码子使用频率比较显示,京海黄鸡GnRHR基因密码子偏好性与3种生物相差很大,不适合进行外源表达。与其他动物GnRHR基因密码子偏好性比较显示,禽类GnRHR基因偏好含有或以G/C结尾的密码子,而其他物种的GnRHR基因无强烈的偏好性。聚类分析结果表明,亲缘关系近的物种之间倾向于拥有相同的密码子偏好性。

人激肽释放酶基因对肾性高血压大鼠主动脉胶原含量的影响及其机制探讨

目的观察重组腺相关病毒介导人激肽释放酶基因对肾性高血压大鼠主动脉胶原含量的影响及其可能的机制。方法将人组织型激肽释放酶基因(HK)克隆入重组腺相关病毒载体(rAAV)中,经三质粒共转染方法在 HEK293细胞中包装成 rAAV-HK 病毒。雄性 Wistar 大鼠24只,随机分为假手术和模型组,采用5/6肾切除的方法构建肾性高血压大鼠模型。模型组大鼠再随机分成单纯手术(n=6)、对照组(n=6)和实验组(n=6)。实验组大鼠单次尾静脉注射1×10^(11)pfU 的 rAAV-HK 病毒。分别于模型构建前、后(基因转染前)及基因转染后1～3月测大鼠尾动脉血压。基因转染3月后处死动物,取其心脏、主动脉和肾脏等脏器提取总 RNA 及蛋白质。主动脉组织切片行天狼星红染色,Western Blot 检测主动脉组织缓激肽 B_2和血管紧张素Ⅱ1型受体(AT_1R)蛋白表达水平。结果 HK 基因转染后3月,实验组大鼠与单纯手术和对照组相比血压明显下降[(163±13)vs(217±16)vs(220±13)mmHg,n=6,P<0.01];主动脉中膜内胶原纤维明显减少;主动脉组织缓激肽 B_2受体蛋白表达水平明显上调;AT_1R 蛋白表达水平则明显下调。结论重组腺相关病毒介导人激肽释放酶基因能够明显降低肾性高血压大鼠血压,同时减少主动脉中膜胶原纤维含量,其机制可能与它上调缓激肽 B_2受体和下调 AT_1R 蛋白在主动脉组织的表达水平有关。

人类激肽释放酶基因4、5在卵巢癌中的表达

目的研究人类激肽释放酶基因4(KLK4)与激肽释放酶基因5(KLK5)在卵巢癌组织中的表达水平,探讨其在恶性肿瘤中的作用机制。方法50例卵巢肿瘤组织标本分为恶性肿瘤组(n=23)、交界性肿瘤组(n=6)和正常或良性肿瘤组(对照组,n=21)。采用荧光定量RT-PCR技术对各组卵巢肿瘤组织标本进行检测,获得KLK4与KLK5的表达水平。结果KLK4在卵巢癌中的表达水平显著高于对照组(P<0.05);KLK5在卵巢癌和交界性卵巢肿瘤中的表达水平也显著高于对照组(P<0.001);KLK5在浆液性囊腺癌中的表达水平显著高于其他组织学类型的恶性肿瘤(P<0.05)和对照组(P<0.001),且低分化浆液性囊腺癌的表达水平高于中分化浆液性囊腺癌的表达(P<0.05)。KLK5的表达水平与血清CA125水平呈正相关。结论KLK5在卵巢癌,尤其是浆液性囊腺癌的发生与发展过程中可能具有潜在促进作用。