基因重组心肌肌钙蛋白Ⅰ融合蛋白的抗肿瘤效应

目的研究基因重组心肌肌钙蛋白I与人工短肽的融合蛋白(CIS)对肿瘤生长的作用。方法用MTT法观察CIS体外对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)生长的作用。利用鸡胚绒毛尿囊膜模型观察CIS对新生血管生长的影响。用6种小鼠肿瘤异位可移植模型观察CIS在体内对肿瘤生长的作用。结果 CIS对HUVEC细胞增殖具有明显抑制作用,并呈剂量依赖关系;鸡胚绒毛尿囊膜实验显示,CIS浓度为5、10 mg·L^(-1)时,新生血管生成的数量明显减少;荷瘤鼠体内异位移植模型实验显示:CIS(10 mg·kg^(-1))处理组肿瘤生长缓慢,瘤体明显小于模型对照组,对S180肿瘤瘤重抑制率85.3%,对Lewis肺癌肿瘤瘤重抑制率87.0%,对H22肝癌肿瘤瘤重抑制率84.2%,对人小细胞肺癌H446肿瘤瘤重抑制率60.42%,对人可移植性肝癌SMMC7721肿瘤瘤重抑制率61.62%,对人胃低分化腺癌BGC823肿瘤瘤重抑制率为41.84%。结论 CIS在体外抑制HUVEC细胞的生长,在鸡胚绒毛尿囊膜实验中,CIS对新生血管生成有明显的抑制作用。在体内,CIS融合蛋白可有效抑制小鼠可移植肿瘤细胞的生长。CIS抗肿瘤效应很可能是通过抑制肿瘤组织中血管内皮细胞的增殖,进而减少肿瘤组织中新生血管生成的数量而达到的。

血清sST2、TNF-α和肌钙蛋白在儿童病毒性心肌炎诊断及预后评估中的价值

目的 探讨血清可溶性生长刺激表达基因2蛋白(sST2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和肌钙蛋白(c TnT)在儿童病毒性心肌炎(VMC)诊断及预后评估中的价值。方法 选择2020年5月至2022年6月我院收治的VMC患儿和开展健康体检的健康儿童各72例,分别设为观察组和对照组。对观察组开展为期1年的随访,根据预后情况将其分为预后良好组(n=50)和预后不良组(n=22)。分别检测观察组、对照组和预后良好组、预后不良组的血清sST2、TNF-α、c TnT水平并予以比较,绘制受试者工作曲线(ROC)分析血清sST2、TNF-α、cTnT联合检测在儿童VMC诊断及预后评估中的价值。结果 与对照组相比较,观察组血清sST2、TNF-α、cTnT水平均较高(P<0.05);与预后良好组相比较,预后不良组血清sST2、TNF-α、c TnT水平较高(P<0.05);由ROC曲线分析,经构建风险评估模型(即血清s ST2、TNF-α、cTnT水平联合检测模式下)诊断VMC以及评估VMC患儿预后的AUC值最高,分别为0.911、0.888且灵敏度、特异度分别为91.67%、90.27%和86.36%、88.00%。结论 血清sST2、TNF-α、cTnT水平联合检测的方式在诊断VMC和评估VMC患儿预后方面具有较高的诊断效能。

基因重组心肌肌钙蛋白I融合蛋白抗肿瘤作用实验研究

目的:研究基因重组心肌肌钙蛋白I 与人工短肽融合蛋白(CIS)对肿瘤生长的抑制作用。方法:用Western Blot法观察对人肝癌细胞MHCC97H的VEGF-A和VEGF-C、MMP-9的影响。用3种人肿瘤异位可移植瘤模型观察CIS在裸鼠体内对肿瘤生长的抑制作用。结果:CIS对MHCC97H细胞,CIS 200 mg/ml,48 h,对VEGF-A表达较肿瘤模型组显著减少,抑制率为23.8%。DDP 2 mg/ml,48 h,对VEGF-A表抑制率为25.8%。CIS 200 mg/ml,48 h,对MMP-9表达较肿瘤模型组减少显著,抑制率为18.1%,DDP 2 mg/ml,48 h,对MMP-9表达比较肿瘤模型组抑制率为12.6%。CIS H组和DDP组对VEGF-C表达抑制作用较弱。荷瘤鼠体内皮下移植瘤模型实验显示CIS (10 mg/kg,SC)处理组肿瘤生长缓慢,瘤体明显小于模型对照组,对人肝癌HCC9204肿瘤瘤重抑制率为54.13%,对人可移植性乳腺癌BCaP-37肿瘤瘤重抑制率为53.88%,对人可移植性结肠癌HCT116肿瘤瘤重抑制率为41.12%。结论:基因重组心肌肌钙I与人工短肽融合蛋白CIS对人肝癌细胞MHCC97H VEGF-A和MMP-9表达具有抑制作用。在体内,CIS融合蛋白可有效的抑制人可移植肿瘤细胞的生长,CIS抗肿瘤效应与抑制肿瘤组织中血管内皮生长因子的表达和人基质金属蛋白酶-9的表达有关。

大鼠心肌肌钙蛋白I基因Lys184缺失突变重组腺病毒载体的构建

目的:构建SD大鼠心肌肌钙蛋白I(cTnI)赖氨酸(Lys)184缺失突变重组腺病毒载体。方法:利用PCR定点突变方法给大鼠cTn I基因引入Lys184缺失突变,将扩增片段克隆至pMD18-T载体,在C末端用PCR法加6×组氨酸(His)标签序列后,再亚克隆至Adeno-X腺病毒DNA,转染HEK 293细胞,包装形成重组腺病毒(Ad-cTnILys184del)。结果:PCR及测序结果表明,重组腺病毒序列正确,Western blot证明有融合突变蛋白表达。结论:本研究成功地构建了大鼠cTnI Lys184缺失突变重组腺病毒载体,为后续的功能研究提供了有价值的研究材料。

人心肌肌钙蛋白I(cTnI)基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化

目的:研究人cTnI基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化。方法:以pCOMb3-cTnI为模板,用PCR方法得到了编码该蛋白的基因,进一步将该基因克隆到中间载体pUCm-T,再酶切得到cTnI基因插入到pKL载体中,构建成表达质粒pKL-cTnI。在BL21细胞中经IPTG诱导表达,利用载体携带6×His纯化标签,以HisTrap Kit纯化重组蛋白,并进行免疫活性测定。结果:融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,并用HisTrap Kit成功纯化目的蛋白。ELISA分析证实该重组蛋白具有与天然心肌肌钙蛋白相似的免疫活性。结论:本研究为建立急性心肌梗死早期诊断试剂奠定了基础。

重组人糖蛋白激素β5/α2融合蛋白在CHO-S细胞中的表达纯化及功能活性分析

目的在悬浮中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO-S)中分泌表达、纯化重组hCGH-CTP融合蛋白,验证其对3T3-L1成熟脂肪细胞脂质积累的影响。方法构建CTP连接肽融合人糖蛋白激素β5/α2重组蛋白表达载体pcDNA3.1-rhCGH-CTP,将其瞬时转染CHO-S悬浮细胞中,大量表达纯化并验证rhCGH-CTP蛋白生物学活性;通过干预3T3-L1成熟脂肪细胞24 h,观察细胞内甘油三酯(TG)水平的变化。结果Western blot结果显示,rhCGH-CTP蛋白在CHO-S细胞中成功表达,表达量可达715.4 mg·L^(-1);用AKTA pure蛋白纯化系统纯化蛋白,SDS-PAGE方法鉴定纯化出的蛋白纯度较高可达90%。此外,在高表达TSHR基因的成熟脂肪细胞3T3-L1中,利用ELISA试剂盒测定不同浓度rhCGH-CTP蛋白干预后胞内cAMP含量明显升高,说明rhCGH-CTP蛋白具有生物活性;油红O染色结果发现,与对照组相比,不同浓度rhCGH-CTP蛋白干预组的成熟脂肪细胞中TG含量明显降低(P<0.05)。结论成功表达并纯化了rhCGH-CTP融合蛋白,其具有良好的生物学活性并能有效降低TG,该研究为后续深入揭示CGH蛋白的生理作用及在临床实践中的潜在应用提供了重要基础。

大鼠心肌肌钙蛋白Ⅰ Asp128Tyr基因突变重组腺病毒载体的构建

目的:构建SD大鼠心肌肌钙蛋白Ⅰ(cardiac troponinⅠ,cTnⅠ)天冬氨酸(Asp,D)128酪氨酸(Tyr,Y)突变(cTnⅠD128Y)重组腺病毒载体,并鉴定。方法:构建野生型SD大鼠cTnⅠ基因全长ORF区克隆,在此基础上,采用PCR定点突变方法对cTnⅠ第128位氨基酸位点引入D128Y突变,将野生型和突变型cTnⅠ基因亚克隆至Adeno-X腺病毒载体,转染HEK 293细胞,包装形成野生型和突变型(Ad-cTnⅠD128Y)重组腺病毒载体;并采用DNA测序、免疫印迹和细胞培养等方法进行鉴定。结果:PCR及测序结果表明,重组腺病毒克隆载体序列正确,免疫印迹证明有融合突变蛋白表达,该突变病毒转染心肌细胞见绿色荧光蛋白表达。结论:本研究成功构建了大鼠cTnⅠD128Y突变重组腺病毒载体,为探讨该突变致心肌肥大的胞内信号通路研究提供了基础。

重组人心肌肌钙蛋白Ⅰ基因工程菌的构建

目的构建稳定、高效表达重组人心肌肌钙蛋白I(cTnI)的基因工程菌株,为临床检测心肌损伤及预后提供诊断试剂材料,促进cTnI诊断标准化的研究。方法采用RT-PCR方法从人心肌组织总RNA中克隆出全长的人cTnI基因,将其插入到pMD19-T克隆载体中,经酶切和测序对目的基因分析,再插入到pET-21a(+)表达载体中,转化BL21(DE3),对诱导表达的目的蛋白行SDS-PAGE和采用锐普心梗仪检测重组蛋白的抗原性并准确定量。连续传代试验验证基因工程菌稳定性。结果克隆了全长的cTnI基因,目的蛋白表达量达菌体总蛋白的38%,重组蛋白抗原性良好,基因工程菌具有较高的稳定性。结论成功构建了稳定、高效表达重组人cTnI的基因工程菌。

中国肥厚型心肌病与肌钙蛋白T基因的相关性研究

目的研究肌钙蛋白T(Troponin T,TNNT2)在中国肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy,HCM)患者中的突变情况。方法对95例无血缘关系的HCM先证者(其中22例为家族性HCM先证者)进行肌钙蛋白T基因(TNNT2)突变筛查,利用聚合酶链反应(PCR)扩增其功能区8、9、10、11、14、15、16号外显子片段,双脱氧末端终止法测序。家系资料调查包括:临床表现、体格检查、心脏超声和心电图。结果 16例FHCM患者及79例SHCM患者均未发现TNNT2基因的错义突变、移码突变、剪接突变。仅在9号外显子检出一同义突变,为ATC→ATT,均编码异亮氨酸(Ile)。结论 TNNT2不是我国肥厚型心肌病的常见致病基因。

中国肥厚型心肌病患者心肌肌钙蛋白I基因突变类型的研究

目的研究中国肥厚型心肌病患者心肌肌钙蛋白I(cTnI)基因突变类型。方法肥厚型心肌病患者58例,男36例,女22例,年龄10～77岁,平均(46±18)岁。正常对照100例,男60例,女40例,年龄10～68岁,平均(33±12)岁。聚合酶链反应(PCR)扩增肥厚型心肌病患者及正常对照组cTnI基因5、7及8号外显子,结合单链构型多态性及直接测序法分析结果。结果未见国外已报道的cTnI基因突变类型(Pro82Ser,Arg145Gly,Arg145Gln,Arg162Trp,ΔAAG183,Asp196Asn,Gly203Ser,Ser199Asn,Lys206Gln,8号外显子缺失33bp),但在7号外显子发现一新的Arg145Trp突变。此外,在7号外显子尚见179位密码子GAG→GAA多态性。结论所研究的肥厚型心肌患者群未发现国外报道的cTnI基因突变类型。与国外比较,中国肥厚型心肌病cTnI基因突变类型可能具有不同的特点。

心脏型肌钙蛋白Ⅰ基因4693 C／T突变导致家族性心尖部肥厚型心肌病

目的研究中国人肥厚型心肌病(HCM)致病基因,分析基因型与临床表型的关系。方法在一HCM家系中进行心脏型肌钙蛋白Ⅰ基因(TNNI3)、心脏型肌钙蛋白T基因(TNNT2)、心脏型肌球蛋白结合蛋白C基因(MYBPC3)和β-肌球蛋白重链基因(MYH7)突变筛查,利用聚合酶链反应(PCR)扩增其功能区的外显子片段,双脱氧末段终止法测序。家系调查资料包括临床表现、体格检查、心脏超声和心电图。结果在该家系接受家系调查的8例有亲缘关系的对象中5例携带TNNI3 4693C/T(R145W)突变,全部发病,外显率100%。正常对照组同一位置未见异常,该突变位点使TNN13基因第7号外显子143位的精氨酸变为色氨酸,5例患者中4例表现为心尖部肥厚为主,1例表现为室间隔基底段肥厚为主,临床症状表现为轻微的胸闷。MYH7、MYBPC3及TNNT2基因未发现突变。结论TNNI3基因4693C/T突变是该HCM家系的致病突变,其外显率为100%。其携带者主要表现为心尖部肥厚为主,临床表型较好。对于心尖部肥厚为主的HCM家系有必要进行TNNI3的突变筛查。

中国人群肥厚型心肌病患者心肌肌钙蛋白基因突变研究

目的:初步探讨中国人群肥厚型心肌病患者心肌肌钙蛋白T基因突变情况,为该病的早期防治和康复介入奠定理论基础。方法:提取58例肥厚型心肌病(hypertrophiccardiomyopathy,HCM)患者外周血白细胞基因组DNA,聚合酶链反应(PCR)扩增心肌肌钙蛋白T(cTnT)基因8、9、11号外显子,产物做单链构象多态性(SSCP)分析,出现异常条带者直接测序验证。结果:58例临床确诊的HCM患者cTnT基因8,9,11号外显子,除160位密码子存在ATC和ATT多态性外,未发现基因位点的异常。结论:与国外报道的肥厚型心肌病约20%是由肌钙蛋白T基因突变引起相比较,中国人群肥厚型心肌病患者基因突变可能存在不同的特点。

人心肌肌钙蛋白I-C融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化

提取人心肌组织总RNA,RT PCR扩增出人心肌肌钙蛋白I(cardiactroponinI,cTnI)和肌钙蛋白C(TnC)基因,利用人工合成的可编码 19个中性氨基酸残基为主的DNA序列(Linker),将cTnI和TnC基因连接,插入到质粒pET15b中,将鉴定正确的重组pET15b质粒转化入大肠杆菌BL2 1(DE3)pLysS中,用异丙基 β D$C硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白质表达.结果在大肠杆菌中成功实现了全长cTnI C融合蛋白(cTnI linker TnC)的稳定可溶性高表达,在摇瓶中表达量可达 2 1mg/L.利用目的蛋白N端的组氨酸 标签"(His tag),经一步Ni2 + Sepharose柱亲和层析纯化,得到了聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯蛋白质.经初步研究,cTnI C具有较好的免疫原性和稳定性,有望成为cTnI测定系统可溯源的候选参考物质。

肥厚型心肌病心肌肌钙蛋白Ⅰ相关激酶TNN13K基因突变的研究

目的对肥厚型心肌病患者进行TNNI3K基因进行测序分析,探讨此范围内有无基因突变位点。方法对56例无血缘关系的肥厚型心肌病患者及30名健康对照者的TNNI3K基因第18～19及23外显子进行聚合酶链反应扩增产物,设计内引物直接测序,观察有无基因突变,并对发生突变的患者进行临床特点分析。结果肥厚型心肌病患者及正常对照者在TNNI3K基因第18～19及23外显子未发现突变位点。结论目前在中国人群肥厚型心肌病患者中未发现TNNI3K基因突变位点。

人外周血心肌肌钙蛋白Ⅰ基因表达水平与心肌损伤程度的关系

目的:分子生物技术的发展,使监测心肌微小损伤成为可能。探讨外周血心肌肌钙蛋白Ⅰ(cardiactroponinⅠ,cTnⅠ)-mRNA对心肌损伤诊断的临床价值。方法:以电镜观察心肌损伤时的超微结构改变;从心肌组织和外周血中制备总RNA,以随机引物和反转录酶合成cTnⅠ-cDNA,再以巢式PCR扩增和测序分析;将cTnⅠ-mRNA扩增法用于临床诊断,与心肌酶谱(CK,CK-MB,AST,LDH)及cTnⅠ定性比较,以探讨其临床价值。结果:心肌损伤组织超微结构表现为心肌线粒体肿胀、嵴断裂、严重空泡样变及细胞核异形变、染色质浓缩边聚。巢式PCR法扩增cTnⅠ-mRNA片段的灵敏度为2μg/L,测序分析证实从心肌组织及外周血中扩增基因片段与原序列完全一致。对62例慢性心脏病患者外周血cTnⅠ-mRNA的扩增分析,其阳性率明显高于酶谱或cTnⅠ定性分析(P<0.05)。结论:心肌损伤时cTnⅠ-mRNA释放进入外周血,为心肌损伤诊断的敏感基因标志物。

心肌肌钙蛋白T基因突变在心肌病发病机制中的研究进展

肥厚型和扩张型心肌病中,基因缺陷分别占发病的50%和35%,其病理生理机制,主要包括肌小节蛋白基因突变引起的收缩力产生缺陷,细胞骨架蛋白基因突变引起的收缩力传递缺陷等。心肌肌钙蛋白T将肌钙蛋白C和肌钙蛋白I连接到肌动蛋白和原肌球蛋白上,在心肌细胞收缩和舒张过程中发挥重要作用。在肥厚型和扩张型心肌病中发现了多种心肌肌钙蛋白T的基因突变,围绕心肌肌钙蛋白T的研究有助于阐明心肌病的发病机制。本文总结了心肌肌钙蛋白T基因突变在心肌病发病机制中的研究情况。

异丙酚对严重烧伤后大鼠心肌细胞c-fos基因表达及血清肌钙蛋白I浓度的影响

目的研究异丙酚对严重烧伤后大鼠心肌c-fos基因表达及血清肌钙蛋白I浓度的影响,从分子水平探讨严重烧伤后大鼠心肌损伤的保护机制。方法96只大鼠随机分为3组:(1)对照组(严重烧伤后未治疗);(2)严重烧伤后大鼠生理盐水治疗组;(3)大鼠严重烧伤后异丙酚间断治疗组;(4)大鼠严重烧伤后异丙酚持续治疗组,持续靶控静注异丙酚。分别于伤后30、60、360、720min等时间点,测定心肌细胞c-fos基因改变以及肌钙蛋白I的变化。结果异丙酚能显著抑制严重烧伤后大鼠心肌细胞c-fos基因的表达;同时,肌钙蛋白I较对照组亦有显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论异丙酚可能对严重烧伤后大鼠心肌具有分子水平保护作用。

心肌肌钙蛋白Ⅰ基因突变与心肌病的研究进展

心肌肌钙蛋白I(cTnI)是心肌肌钙蛋白复合物的亚单位之一,与心肌肌钙蛋白T和C相互作用,与肌动蛋白-原肌球蛋白结合从而抑制肌动蛋白-肌球蛋白的收缩作用。在肥厚型、扩张型和限制型心肌病中发现30多种cTnI基因的突变,cTnI基因突变转基因小鼠也反映了心肌病的特征。本文总结了cTnI基因突变在心肌病发病机制中的研究情况。

心肌肌钙蛋白Ⅰ基因4 650G/C突变与肥厚型心肌病

目的:调查中国人群肥厚型心肌病(HCM)患者肌钙蛋白Ⅰ基因突变的发生情况,并分析基因型与临床表型之间的关系。方法:对65例HCM患者、60例正常对照者通过聚合酶链反应扩增心肌肌钙蛋白Ⅰ基因第7、8号外显子片段,以测序的方法寻找突变位点,并了解基因型明确的HCM患者的临床特点。临床资料包括症状、体格检查、心电图和心脏超声心动图。结果:在1例31岁女性患者的肌钙蛋白Ⅰ基因第7号外显子上发现了一个新的错义突变位点4650G/C(H130Q)。由于在60例正常对照组中未见异常,且该突变引起的氨基酸改变属于极性中性氨基酸置换为碱性氨基酸,故推测此突变位点为该患者的致病基因位点。结论:心肌肌钙蛋白Ⅰ发挥抑制心肌收缩的作用,推测心肌肌钙蛋白Ⅰ基因4650G/C(H130Q)的基因突变可导致肥厚型心肌病的发生。

人心肌肌钙蛋白I基因的克隆及其在大肠埃希菌中的表达

目的从人心肌组织中克隆出心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)的cDNA,构建成表达重组体导入特定宿主菌,以期大量表达并获得高纯度的心肌肌钙蛋白I,为临床检测心肌损伤及预后提供诊断试剂材料。方法利用RT-PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人心肌肌钙蛋白I的cDNA片段,将其插入原核表达载体形成重组体并导入宿主菌BL21(DE3)中,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,表达出带6个组氨酸标签的融合蛋白,Ni-NTA树脂纯化后行Western blot进行鉴定。结果成功获取了人cTnI的cDNA,并在大肠埃希菌中高效表达。经Ni-NTA树脂纯化后获得的产物可与其特异性单克隆抗体反应。结论成功克隆了cTnI基因,构建的重组体能够在大肠埃希菌中高效表达,经纯化可获得电泳单点纯的cTnI蛋白。