携带小鼠白细胞介素-12 siRNA基因重组腺病毒载体的构建及其在树突状细胞中的表达

目的:构建载有白细胞介素-12干扰RNA(IL-12si RNA)基因的,能在树突状细胞(DC)表达的重组腺病毒载体,为免疫耐受提供基础。方法:将IL-12p35si RNA和IL-12p40si RNAcDNA克隆于腺病毒穿梭质粒pShuttle2,得到重组质粒,并与腺病毒骨架质粒BD Adeno-XTM体外连接后代共转化大肠杆菌DH5α菌株,重组腺病毒质粒经过293细胞的包装扩增及氯化铯(CsCl)纯化,生成带有IL-12p35和IL-12p40si RNA基因的重组腺病毒载体,感染DC细胞。结果:经形态学、病毒DNA酶切、聚合酶链反应(PCR)和逆转录(RT)等方法的鉴定,证实了载体构建的正确性;经测定,病毒滴度为2.5×1010efu/ml。结论:成功构建带有IL-12p35si RNA和IL-12p40si RNAcDNA的重组腺病毒载体,其所携带的载体能够转染小鼠DC并干扰其在DC中表达,为进一步的研究奠定了基础。

热休克蛋白70基因重组腺病毒载体微胶囊化及口服转染的研究

目的 为利用热休克蛋白 70 (heat shockprotein,HSP70 )防治严重烧伤后缺血缺氧性损伤的基因治疗提供可行的基因转染途径。 方法 利用微胶囊技术包裹含HSP70基因的复制缺陷型重组腺病毒载体 ,检测其在人工胃、肠液中的融出率 ,并进行大鼠的口服转染 ,检测目的基因表达。 结果 用微胶囊技术可成功包裹腺病毒载体。制备的微胶囊在人工胃液中仅有少量崩解 ,而在肠液中则半数崩解。RT PCR检测大鼠口服转染微胶囊后目的基因表达确切。 结论 利用微胶囊技术可成功包裹含HSP70基因的腺病毒载体 ,并保护其免受胃液损伤 ,在肠道中被释放吸收。

Wilson病ATP7B基因重组腺病毒载体Ad-ATP7B的构建

目的构建Wilson病基因ATP7B的重组腺病毒载体。方法分别以BamHⅠ+SalⅠ双酶切pcDNA3.0/ATP7B和pDC315,将ATP7BcDNA目的基因片段和线性化的pDC315连接,定向克隆构建pDC315/ATP7B,以PCR和酶切的方法鉴定。pDC315/ATP7B与腺病毒骨架共转染293细胞构建Ad-ATP7B,PCR进行鉴定。结果经PCR和酶切鉴定证实pDC315/ATP7B构建成功。pDC315/ATP7B与腺病毒骨架共转染293细胞后见明显的毒斑,说明二者在293细胞中同源重组并包装成功。经PCR证实重组腺病毒Ad-ATP7B构建已完成。结论本实验成功构建了ATP7B外源目的基因序列完全正确的重组腺病毒载体Ad-ATP7B,为下一步采用ATP7B基因重组腺病毒载体对Wilson病进行基因治疗打下了基础。

人乳头瘤病毒11型E7蛋白基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的构建人乳头瘤病毒11型(HPV11)E7蛋白基因腺病毒载体,并在真核细胞表达。方法用PCR法,扩增出HPV11E7基因,定向克隆至pENTR-TOPO载体形成重组质粒TOPO-E7。TOPO-E7与腺病毒载体pAD/CMV/V5-DESTTM重组反应,E7基因被重组到腺病毒载体上。该载体经PacI酶切,脂质体法转染人胚肾293A细胞,获得重组腺病毒载体pAD-E7。pAD-E7转染人HaCaT细胞,激光共聚焦显微镜分析E7蛋白表达情况。结果经酶切及序列分析鉴定,重组质粒TOPO-E7成功构建。重组子pAD-E7转染293A细胞后,获得滴度为1.4×107pfu/mL的重组腺病毒载体。该载体转染HaCaT细胞,48h后激光共聚焦显微镜下可见细胞内E7蛋白表达。结论重组腺病毒载体能有效介导HPV11E7基因在真核细胞的表达。

小鼠白细胞介素-15基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

我们利用转基因技术体外构建表达小鼠白细胞介素．15（mIL-15）基因的复制缺陷型腺病毒载体，为研究mIL-15基因修饰树突状细胞（DC）诱导肿瘤免疫反应奠定基础。

重组腺病毒载体介导共刺激分子B7.1基因对儿童肝母细胞瘤体外淋巴细胞增值的影响

目的研究含hB7-1基因的重组腺病毒载体对儿童肝母细胞瘤体外淋巴细胞增值的影响。方法以腺病毒为载体,将hB7-1基因转入HepG2细胞,以FCM检测HepG2和HepG2/hB7-1细胞表面B7-1分子的表达情况。观察HepG2和HepG2/hB7-1细胞的生长曲线。用混合淋巴细胞培养法检测瘤苗对T淋巴细胞增殖的影响。结果HepG2细胞表面B7-1分子表达水平低,其阳性率为1.1%。而HepG2/hB7-1的B7-1分子表达阳性率达到18.5%,B7-1基因的表达水平提高16.8倍。HepG2和HepG2/BB-102的生长曲线相比,后者生长曲线上升减缓,生长速度减慢。B7-1分子的表达促进了淋巴细胞的增殖,较对照组有显著性差异(P<0.05)。结论1.HepG2表面B7-1分子低水平表达是其弱免疫原性的主要原因。2.含hB7-1基因的重组腺病毒载体转染HepG2可以获得B7-1分子高表达的细胞株。3.重组腺病毒载体的转染可以降低肝母细胞瘤细胞的恶性表征。4.转染含hB7-1基因的瘤苗可以促进T淋巴细胞的增殖。

人骨保护素基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建人骨保护素(hOPG)基因的重组腺病毒载体并检测其转染能力。方法采用基因工程技术,将hOPG基因片段插入到腺病毒载体质粒pAdTrack-CMV上,利用PadEasy系统与骨架质粒在大肠杆菌BJ5183胞内进行同源重组,经293细胞包装、扩增,得到携带hOPG基因的重组腺病毒AdEasy-PAdtrack-CMV-hOPG,将重组腺病毒AdhOPG对大鼠骨髓基质细胞(rMSCs) 进行感染。采用PCR方法对重组腺病毒载体进行鉴定,利用绿色荧光报告基因转染结果,以荧光计数法检测重组腺病毒的滴度。结果酶切鉴定及PCR结果证明hOPG基因重组腺病毒载体成功, 病毒滴度可达2．5×108pfu／ml,具有很强感染能力,结论应用细菌内同源重组法,成功构建了含 hOPG重组腺病毒载体。

小鼠端粒酶逆转录酶基因重组腺病毒转染对树突状细胞功能的影响

用携带目的基因的病毒载体转染树突状细胞（DC）已广泛应用于抗肿瘤和诱导耐受等方面的实验研究和治疗。但用病毒载体转染DC过程中，存在病毒本身常能影响DC的抗原提呈细胞功能，有文献报道痘苗病毒载体和单纯疱疹病毒载体转染DC后可阻碍DC成熟和下调成熟DC表面的共刺激分子，因此，避免病毒载体干扰DC的功能十分重要。端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）作为广谱的肿瘤抗原对激发机体特异性抗肿瘤免疫反应具有一定作用，本研究在前期构建出携带小鼠端粒酶逆转录酶基因重组腺病毒载体（Ad—mTERT）的基础上研究其转染DC后对DC细胞表型及抗原提呈功能的影响。

rAAV2-slug-siRNA对原位胰腺癌移植瘤转移和血管生成影响的实验研究

目的:研究slug基因的RNA干扰重组腺病毒载体(rAAV2-slug-siRNA)对原位胰腺癌移植瘤的转移和血管生成的影响。方法:建立胰腺癌细胞株AsPC-1裸鼠原位胰腺癌移植瘤模型,随机分成3组,每组8只,分为空白对照组(腹腔注射生理盐水)、阴性对照组(腹腔注射rAAV2-GFP)、实验组(腹腔注射rAAV2-slug-siRNA)。10周后利用CO2麻醉法处死裸鼠,观察原位胰腺癌移植瘤的重量,抑瘤率,肝、胃肠、腹腔转移,腹水等情况,及肿瘤细胞微血管密度(MVD)。RT-PCR检测移植瘤的slug mR-NA表达,Western blot检测slug蛋白的表达。结果:胰腺癌细胞株AsPC-1裸鼠原位胰腺癌移植瘤模型建立成功,成瘤率100%。实验组原位胰腺癌移植瘤瘤重明显低于阴性对照组(P<0.05),抑瘤率为70.83%。阴性对照组诱发的裸鼠胰腺癌质地硬,肿块向四周浸润并形成癌性粘连,与阴性对照组相比,实验组腹膜、肝、毗邻脏器转移率和形成腹水率均明显下降(P<0.05)。实验组MVD明显少于阴性对照组(P<0.05),slug mRNA相对表达量(RT-PCR)和slug蛋白相对表达量(Western blot)明显低于阴性对照组(P<0.05)。结论:rAAV2-slug-siRNA可能通过抑制肿瘤血管生成而抑制原位胰腺癌移植瘤转移。

肝、胆（080276～080326）

肝癌靶向性SEA基因重组腺病毒载体的构建及体外生物学活性鉴定；RhoC-siRNA表达载体对肝癌细胞生长速度及侵袭力的影响；骨桥蛋白在肝癌中表达的临床意义；大鼠实验性肝癌发生过程中存活素基因表达的动态观察；超声引导射频消融对肝癌患者免疫功能影响的初步研究。