重组蛋白多肽药物的临床药代动力学

扼要介绍重组蛋白多肽类药物的临床药代动力学研究的内容、方法和特点。综述了重组内皮抑制素、重组糖基化血小板生成素、改构肿瘤坏死因子、重组糖基化尿激酶原、人源化单抗trastuzumab和重组人肿瘤坏死因子受体临床药代动力学研究的方法学。

酵母中表达基因工程重组蛋白药物的研究进展

本文主要从酵母载体系统的选择、酵母表达宿主的选择、多拷贝菌株的构建、高密度发酵培养酵母细胞、应用酵母系统表达外源基因的研究现状、酵母表达系统的缺陷及对策等几个方面综述了近年来酵母表达体系在基因工程重组蛋白药物开发方面的研究进展。

高迁移率蛋白-17(HMG-17)基因重组多肽的制备及其抗菌结构域的研究

为构建HMG-17原核表达系统,研究HMG-17抗菌功能与结构的关系,提取人LAK细胞总RNA,设计合成相应引物,应用RT-PCR扩增HMG-17和HMG-17α螺旋结构成熟肽cDNA,以pGEX-1λT为载体,构建HMG-17和HMG-17α螺旋结构基因大肠杆菌表达载体。该载体表达的融合蛋白GST-HMG-17和GST-HMG-17α经亲合层析、凝血酶酶切、AU-PAGE胶回收后获得高度纯化的HMG-17和HMG-17α肽,对纯化产物进行MEC、MIC、MBC等试验,与杀菌活性较强的抗菌肽HNP-1、NP-1进行活性对比,证明其具有较强的杀菌活性,且具有盐敏感性。并证明了HMG-17的α结构域是HMG-17的主要抗菌功能区域。

转基因植物生产重组药物蛋白的研究进展

转基因植物作为一种新型生物反应器,可以安全、经济、有效的生产各种重组蛋白,以此作为大规模的重组药物生产平台备受瞩目。但是表达量低、下游处理复杂、糖基化结构改变是植物反应器中经常遇到的困难,这些困难限制了植物表达重组药物蛋白的商业化发展。针对这些问题,人们分别采用不同的生物技术策略加以解决,对此做一简要综述。

动物细胞表达的基因重组蛋白质药物

介绍了美国FDA 1996年至今批准的利用动物细胞表达的重组蛋白质药物 ,主要介绍了组织型纤溶酶原激活剂突变体、β 干扰素、新型红细胞生成刺激蛋白、凝血因子Ⅶ ,并对它们的结构改造、生物活性、临床适应证、分离纯化等做了介绍。

基因重组蛋白质药物的研究进展(综述)

生物医药业是现代医药中发展最快的部分。近20年来以基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程为代表的现代生物技术发展迅猛,并日益影响和改变着人们的生产与生活方式。重组蛋白质药物是指利用DNA重组技术生产的蛋白质。一个重组蛋白质药物的诞生需要以下几部分工作,首先是鉴定具有药物作用活性的目的蛋白质,分离或合成编码该目的蛋白质的基因,然后将其插入合适的载体,转入宿主细胞(大肠杆菌等细菌、酵母或哺乳动物细胞),构建能高效表达目的蛋白质的菌种库或细胞库,最后扩大规模应用发酵罐或生物反应器进行发酵或细胞培养生产目的蛋白质药物。

家鸡Leptin成熟肽cDNA的克隆、重组蛋白表达及纯化

从 18周龄鸡卵巢组织中抽提总 RNA,使用六聚体随机引物反转录后 ,用鸡 L eptin(瘦素 )特异性引物扩增出鸡L eptin编码区第 5 2～ 4 6 0 bp的长度为 4 0 9bp的 c DNA片段。根据鸡 L eptin的 3′端第 4 6 0～ 4 92 bp序列设计了 3条部分相互重叠并且顺序串联延伸的下游反义引物 ,并在最后 1条引物 3′端连接上 Eco R 切点 ;在以上用于反转录扩增的 5′端引物的 5′端连接一 Bam H 切点。用该 5′端引物分别与 3个 3′端引物配对 ,利用反转录扩增出的 4 0 9bp的L eptin c DNA片段作为第 1模板进行扩增 ,扩增产物再作为模板与下一引物对再次扩增。经 3次扩增得到编码鸡 L ep-tin成熟肽的全长 4 5 1bp的 c DNA序列。将该 4 5 1bp的 L eptin c DNA序列经 Bam H 和 Eco R 双酶切后 ,克隆入表达质粒 p RSET A的 Bam H 和 Eco R 两酶切位点之间 ,构建成表达质粒 p L ep- SCAU。转化有重组表达质粒 p L ep-SCAU的大肠杆菌 BL 2 1(DE3)在 L B培养基中培养后 ,经 IPTG诱导表达出相对分子质量为 2 0 10 0的鸡 L eptin融合蛋白和少量 4 0 2 0 0的 L eptin融合蛋白。L eptin融合蛋白的表达在 IPTG浓度为 0 .0 5 mmol/ L 时达到最高 ,占总菌体蛋白的 32 .6 %。用 Ni- NTA凝胶从 7L 发酵培养菌裂解液中纯化出 180 m

人牙胚釉原蛋白成熟肽基因的克隆

目的:克隆人釉原蛋白成熟肽编码区基因片断,并构建含有该基因的重组表达质粒。方法:从引产胎儿牙胚组织中抽提总RNA,以Oligo(dt)为引物,逆转录合成牙胚cDNA利用PCR,从cDNA中扩增出人釉原蛋白成熟肽编码序列(约540bp),所得目的基因片断插入表达载体质粒PQE30,转化到大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆,抽提重组质粒DNA,通过PCR、酶切和核苷酸序列分析,鉴定阳性克隆。结果:样品质粒测序证实,质粒PQE30中插入的基因片段与人釉原蛋白成熟肽基因序列完全相同。结论:从人胚胎的牙胚组织中克隆到釉原蛋白成熟肽编码序列,成功构建含有人釉原蛋白成熟肽基因的重组表达质粒。

人骨保护素成熟肽表达载体的构建、表达及重组蛋白免疫学鉴定

目的 :构建人骨保护素 (OPG)成熟肽cDNA重组表达载体 ,实现其在毕赤酵母中的高效表达。方法 :由人成骨细胞提取总RNA ,经RT -PCR扩增得到人OPG成熟肽cDNA ,克隆入分泌型表达载体 pPIC9K ,转化酵母细胞 ,G418筛选多拷贝整合的重组子进行甲醇诱导表达 ,产物行Westernblotting 鉴定。结果 :成功构建了人OPG成熟肽表达载体 ,该载体能在酵母细胞中获得分泌表达 ,诱导96h的表达量占上清总蛋白的30 %。重组蛋白相对分子质量约55ku ,可被OPG抗体识别。结论 :重组人OPG成熟肽在酵母表达系统获得较高水平表达 ,为进一步研究开发基因工程药物准备了条件。

抗菌肽重组表达体系及基因表达调控研究进展

抗菌肽（antimicrobial peptides）是一类具有抗菌活性的天然小分子蛋白。自1975年瑞典科学家Boman等从蚕蛹身上分离得到第一个抗菌肽天蚕素（cecropin）以来,人们又在昆虫、两栖类、水产动物,以及包括人在内的哺乳动物甚至植物及细菌等广泛的生物谱中发现了至少1 700余种抗菌肽[1]。

重组人血小板生成素（rhTPO） 国际上最被看好的基因工程蛋白药物

rhTPO是国际上最被看好的基因工程蛋白药物之一。目前，国外公司的研制进度尚处Ⅲ期临床试验阶段。而沈阳三生制药股份与有限公司率先完成Ⅱ/Ⅲ期临床试验，获得新奇证书和生产批件，即将进行规模化生产。

人β2微球蛋白成熟肽基因克隆及其原核表达载体的构建

根据GenBank基因库中人β2微球蛋白(β2m)成熟肽基因序列设计2对引物,使用RT-PCR法从健康人血液中扩增人β2m成熟肽基因,扩增产物进行T-A克隆和测序.结果表明,获得的人β2m成熟肽基因为297 bp,与模板序列的同源性为100%.利用基因重组技术,将β2m成熟肽基因亚克隆入pET-28 a(+)载体中,经PCR、酶切和测序鉴定,证实所获重组表达质粒pET-28/Humβ2m中含有目的片段,且连接、构建正确,表明成功构建了重组表达质粒pET-28/Humβ2m.

重组人血小板生成素（rhTPO）：国际上最被看好的基因工程蛋白药物

rhTPO是国际上最被看好的基因工程蛋白药物之一。目前，国外公司的研制进度尚处于期临床试验阶段。而沈阳三生制药股份有限公司率先完成Ⅱ/Ⅲ期临床试验，获得新药证书和生产批件，即将进行规模化生产。

RGD特异性结合多肽与重组改构人肿瘤坏死因子融合基因的克隆表达及其抑瘤活性

目的构建RGD多肽与重组改构人肿瘤坏死因子融合基因,进一步提高rmhTNF的临床疗效。方法应用基因重组技术构建了CRGDC与rmhTNF的融合基因,在E.coliDH5α中诱导表达重组蛋白RGDrmhTNF,采用溶菌酶法裂解菌体,裂解上清经硫酸铵沉淀、阴阳离子交换层析纯化后,用S180荷瘤小鼠模型和L929细胞体外杀伤实验测定纯化的重组蛋白RGDrmhTNF的体内、外杀伤活性。结果正确构建了编码RGDrmhTNF融合基因,重组工程菌升温诱导后以部分可溶形式表达RGDrmhTNF,纯化后纯度为96.88%,体外对L929细胞杀伤作用的比活性为3.6×108IUmg,与rmhTNF相当(3.0×108IUmg)。在S180荷瘤小鼠模型中,当RGDrmhTNF剂量为12×105IUkg时,对肿瘤的生长抑制率为84.9%,显著高于相同剂量的rmhTNF(肿瘤抑制率为59.09%,P<0.01)和环磷酰胺组(肿瘤抑制率为71.21%,P<0.01)。结论重组蛋白RGDrmhTNF可以提高rmhTNF的治疗效果。

生物样品中蛋白质和肽类药物测定方法的研究进展

随着生物技术的发展和基因工程技术的应用，越来越多的蛋白质和肽类药物被开发并应用于临床，如重组干扰素α-2a、重组人白介素-2等。这类药物生理活性强、疗效高，日益受到人们的重视。由于蛋白质和多肽类药物与化学合成小分子药物在理化性质、药动学特点等方面存在明显的差异，体内过程的影响因素也较复杂，而对生物样品中蛋白质和肽类药物的测定则是深入探讨其药动学特点及规律的主要难点。

重组人血小板生成素（rhTPO）国际上最被看好的基因工程蛋白药物

rhTPO是国际上最被看好的基因工程蛋白药物之一。目前，国外公司的研制进度尚处于Ⅱ期临床试验阶段。而沈阳三生制药股份有限公司率先完成Ⅱ/Ⅲ期临床试验，获得新药证书和生产批件，即将进行规模化生产，三生公司还获得两项国家发明专利授权，拥有处主知识产权，研制进度和水平在国际上处于领先地位。三生公司将在国际上最先实现该产品的产业化，为我国医药事业的发展做出新的贡献。

重组人血小板生成素（rhTPO）——国际上最被看好的基因工程蛋白药物

rh TPO是国际上最被看好的基因工程蛋白药物之一。目前，国外公司的研制进度尚处于Ⅲ期临床试验阶段。而沈阳三生制药股份有限公司率先完成Ⅱ/Ⅲ期临床试验，获得新药证书和生产批件，即将进行规模化生产。三生公司还获得两项国家发明专利授权，拥有自主知识产权，研制进度和水平在国际上处于领先地位。三生公司将在国际上最先实现该产品的产业化，为我国医药事业的发展做出新的贡献。

重组人血小板生成素（rhTPO）国际上最被看好的基因工程蛋白药物

rhTPO是国际上最被看好的基因工程蛋白药物之一。目前，国外公司的研制进度尚处于Ⅱ期临床试验阶段。而沈阳三生制药股份有限公司率先完成Ⅱ/Ⅲ期临床试验，获得新药证书和生产批件，即将进行规模化生产。三生公司还获得两项国家发明专利授权，拥有自主知识产权。

重组鸡白细胞介素18对不同基因型新城疫病毒HN基因表达蛋白免疫活性的影响

白细胞介素18（IL-18）是被广泛研究的细胞因子佐剂之一。研究选择了IL-18作为纯化蛋白多肽的佐剂，观察其对多肽疫苗的免疫应答作用，从而为研制新型的多肽疫苗奠定一定的理论基础。

重组蛋白sCAR-TMTP1增强腺病毒对骨肉瘤细胞基因转染效率的研究

目的提高腺病毒(adenovirus,ADV)在缺乏柯萨奇腺病毒受体(coxsackie and adenovirus receptor,CAR)的骨肉瘤细胞中的转染效率。方法通过昆虫(Bac-to-Bac)杆状病毒表达系统表达含有CAR胞外段(s CAR)及TMTP1肽的重组蛋白(s CAR-TMTP1),并对其纯化、鉴定。流式细胞仪分别检测骨肉瘤细胞及人胚肾细胞293(HEK293)的CAR表达水平,ADV对其的感染效率及FITC-TMTP1的结合能力。重组蛋白s CAR-TMTP1与ADV共同孵育形成复合物,流式细胞仪研究其在缺乏CAR的骨肉瘤细胞(MG-63)中的转染效率。结果表达及纯化的s CAR-TMTP1蛋白在相对分子质量约31 000处可见特异蛋白条带,感染的sf9细胞裂解上清可与兔抗小鼠s CAR单克隆抗体发生特异性反应。MG-63可与FITCTMTP1特异结合,其CAR表达水平低,ADV转染效率低。经s CAR-TMTP1修饰后的ADV/GFP对MG-63细胞的感染效率显著高于未经修饰的含报告基因GFP的ADV(ADV/GFP)。结论重组蛋白s CAR-TMTP1可显著提升ADV对缺乏CAR的骨肉瘤细胞的转染效率。