口蹄疫病毒多基因重组质粒的体外表达及衣壳组装

PCR扩增获得包含口蹄疫病毒P1、2A、3C、3D及部分2B编码区的目的基因片段P12X3C3D,将P12X3C3D经AflⅡ和XbaI双酶切后,定向克隆于真核表达质粒载体pcDNA3.1(+);另将PCR扩增获得的P12X3C3D直接与真核表达质粒载体pTARGETTM连接,进行筛选、鉴定及DNA序列分析,分别获得重组质粒pcDNA3.1/P12X3C3D、pTARGET/P12X3C3D。将重组质粒分别转染BHK-21细胞,通过双抗体夹心ELISA方法和间接免疫荧光标记方法检测细胞中表达的口蹄疫病毒抗原,用磷钨酸负染,以电子显微镜观察转染重组质粒的细胞中组装的口蹄疫病毒空衣壳。结果表明,口蹄疫病毒基因组片段正确克隆到真核表达质粒载体上,重组质粒pcDNA3.1/P12X3C3D、pTARGET/P12X3C3D均可在BHK-21细胞中表达FMDV目的蛋白。其中重组质粒pTARGET/P12X3C3D表达的口蹄疫病毒抗原蛋白,能够在细胞内正确组装成病毒空衣壳。

猪β_2-AR基因重组质粒的快速筛选

为建立一种高效快速鉴定重组质粒的实验方法。将猪β2 -肾上腺素能受体 (β2 -AR)基因与pET - 32C重组 ,构建 β2 -AR基因表达载体pET32CAR。以T7启动子引物和猪 β2 -肾上腺素能受体基因特异性引物为PCR引物 ,挑取重组质粒转化单菌落直接进行PCR。产物经电泳发现 ,5个候选克隆中有 3个克隆扩增出了一条约 2kb的特异性条带 ,并且插入方向正确。随机选取其中 1个克隆用限制性酶切鉴定以及DNA测序验证PCR筛选的正确性。研究结果表明 :在采用PCR方法对重组克隆进行鉴定时 ,可以直接使用细菌菌落参与反应 ,而无须提取克隆的DNA。与传统的实验方法相比 ,筛选的时间缩短至 3～ 4h ,大大提高了重组DNA的筛选效率。

大肠杆菌VT噬菌体受体基因重组质粒的构建

取含有卡那霉素抗性 ( Kan R)基因的自杀性质粒 p JP56 0 3和含 vpr全长基因的 p U C19phiΦRID质粒 ,分别采用粘性末端及平末端两种连接法。 2种质粒 H inc 单酶切后进行平末端连接 ,经鉴定未得到重组质粒。p JP56 0 3用 H inc 和X ma I消化 ,回收 3kb的载体质粒 ,p U C19Φ RID用 H inc 和 Age 消化 ,回收 778bp vpr目的基因。通过粘性末端连接 ,转化到感受态细菌 CC118λpir,利用 Kan R进行筛选 ,获得的克隆经 Acc 酶切鉴定和 PCR检测 ,确定得到重组质粒 ,即p YYvpr。将重组质粒的 DNA转化到含有全长 vpr基因的感受态细胞 MC10 6 1,筛选到的克隆经 PCR检测 ,得到一株克隆既扩增出 vpr基因 ,又扩增出 Kan R基因 ,初步鉴定该克隆为 MC10 6 1的 vpr同源基因突变株 ,暂定名为 MC10 6 1△ vpr。从而为研究

TUB2基因重组质粒的构建、鉴定及其在毛壳菌中的转化

根据苯并咪唑类杀菌剂抗性基因的核酸序列 ,在其阅读框架外的上、下游设计一对特异性引物 ,并在其 5′ 端分别加上PstI位点。以pRB12 9质粒为模板 ,PCR扩增得到一条长约 1 4kb的片段 ,经酶切鉴定证明是TUB2基因。将此PCR产物经消化后与同样酶切的pTA质粒连接 ,构建出 pTA TUB2质粒并转化大肠杆菌。再以pTA TUB2质粒为模板 ,PCR扩增该目的基因 ,通过对其核苷酸序列分析证明构建的质粒是含TUB2基因的 pTA TUB2质粒。利用PEG方法 ,将该质粒转化毛壳菌 ,使得对多菌灵非常敏感的毛壳菌能够在 30 0 μg/ml多菌灵的培养基上正常生长 ,其抗药性提高 30 0倍以上 ,且转化稳定性试验表明 ,其抗药性在非选择性培养基上连续培养 10代保持不变。结果表明质粒pTA TUB2对毛壳菌的转化率为 2 7/ (2× 10 5)。

恶性疟原虫Pf12基因重组质粒DNA接种诱导小鼠的免疫应答

目的 观察重组质粒VR10 12 -Pf12DNA直接免疫接种诱导BALB/c小鼠所产生的免疫应答 ,分析Pf12基因的抗原性和作为疫苗抗原候选分子的可能性。方法 构建重组质粒VR10 12 -Pf12 ,直接免疫BALB/c小鼠 ,通过NK细胞杀伤活性、脾T淋巴细胞增殖水平、ELISA、体外抑虫试验测定 ,观察其诱导的细胞和体液应答以及体外抑虫效果。结果 重组质粒VR10 12 -Pf12免疫BALB/c小鼠 ,NK细胞杀伤活性、脾T淋巴细胞增殖水平明显高于对照组 (P <0 0 1) ,诱导小鼠产生的抗体水平明显增高 (P <0 0 1) ,免疫血清在体外能抑制恶性疟原虫的生长、发育。结论 重组质粒VR10 12 -Pf12DNA直接免疫接种诱导BALB/c小鼠产生一定水平的体液和细胞免疫应答 ,其免疫血清在体外对恶性疟原虫的生长、发育有明显的抑制作用。

野生型p53基因重组质粒的构建及其体外抑瘤作用

重组体，用电穿孔方法将其导入有ｐ５３基因突变的人肠癌ＳＷ１１１６细胞，通过标记基因ＮｅｏＲ筛选带外源ｐ５３基因的Ｇ４１８抗药性克隆，以观察抗药性克隆数量，同时对Ｇ４１８抗药性细胞的生长速度及细胞增殖周期进行观察，结果表明：导入ＷＴ—ｐ５３基因能使肠癌ＳＷ１１１６细胞的Ｇ４１８抗药性克隆形成减少，细胞生长速度较对照细胞明显减慢，细胞增殖周期Ｇ１期增加、Ｓ期下降。这些结果证明人野生型ｐ５３基因能抑制肠癌细胞的生长。本研究为大肠癌ＷＴ—ｐ５３实验性基因治疗提供了理论依据，说明基于恢复ｐ５３肿瘤抑制基因功能的基因治疗在治疗结直肠癌方面有着广阔的应用前景。

人巨细胞病毒UL82基因重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 :用基因工程技术克隆人巨细胞病毒 pp71蛋白基因 ,构建高效表达 pp71蛋白的工程菌。 方法 :在传代培养的人包皮成纤维细胞中接种人巨细胞病毒 (HCMV) ,待绝大多数的细胞出现了细胞病变效应后 ,用冻融法收获细胞 ,用PCR技术扩增目的基因 ,将基因片段插入表达载体pGEX 4T 1内 ,转化大肠杆菌DH5 α,TPTG诱导其表达。结果 :获得的工程菌所表达的 pp71蛋白大小约为 710 0 0 ,约占菌体总蛋白的 3 0 0 %。结论 :成功的构建了 pGEX/ pp71重组表达质粒 ,并在DH5 α 中高效表达出pp71蛋白 ,为下一步pp71蛋白的大量表达和纯化奠定了基础。

骨桥蛋白反义基因重组质粒的构建

目的 构建反义骨桥蛋白 (OPN)基因重组质粒 ,以用于肝癌基因治疗的研究。方法 通过设计含有特定酶切位点的引物 ,以含有全长骨桥蛋白基因的质粒 (pBlueScript OPN)为模板 ,将PCR产物反向克隆至 pcDNA3 1(+)真核表达载体上 ,并经酶切鉴定及测序分析。 结果 重组质粒经酶切后出现 913bp长的片段 ,测序分析结果与文献报道结果完全一致。结论 反义骨桥蛋白基因表达质粒克隆成功 。

抑制素基因重组质粒转染大肠杆菌菌种冷藏与冷冻保存的效果分析

通过平皿培养进行抑制素基因重组的质粒转染菌种的冷藏、冷冻两种保存方法与复苏实验,结果表明,冷冻保存方法对于保存抑制素转染菌种的效果好于冷藏保存方法。

Epstein-Barr病毒BLRF2基因重组质粒的构建及其在真核细胞中的表达

Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒ病毒ＢＬＲＦ２基因重组质粒的构建及其在真核细胞中的表达王汉明周玲张晓梅曾毅ＨＷｏｌｆ（中国预防医学科学院病毒学研究所，北京１０００５２）关键词Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒ病毒，ｐＨＤ－ＢＬＲＦ２，短暂表达，Ｐ２３，鼻咽癌Ｅｐｓｔｅｉ...

两种HCV不同结构基因重组质粒DNA诱导免疫应答的比较研究

目的探讨丙型肝炎病毒HCV包膜基因E1E2,对核心基因CDNA疫苗诱生的免疫应答有无增强作用。方法构建包含HCVC或CE1E2基因片段的真核表达载体pHCVC和pHCVCE1E2,分别接种于Balb/c小鼠股四头肌以空载体pcDNA3作为对照,每间隔2wk加强免疫1次。用ELISA法检测免疫小鼠血清中抗HCVC特异性抗体的产生。以pHCVC转染并表达HCcAg的Sp2/0细胞为靶细胞,采用51Cr释放试验检测特异性CTL的杀伤作用。结果两个实验组免疫的20只小鼠均产生抗HCVC特异性抗体,当效/靶细胞比例为100∶1时,CTL的杀伤率均明显高于对照组P0.01;而pHCVCE1E2与pHCVC组之间,无论是抗HCVC抗体的滴度还是CTL的杀伤率均无显著性差异P0.05。结论E1E2基因的加入,并没有增加HCVC基因DNA疫苗诱导的抗HCcAg特异性抗体的滴度和CTL的杀伤作用。

携带前强啡肽基因重组质粒的构建及鉴定

强啡肽（dynorphin）是作用于κ-阿片受体的神经肽，广泛分布于外周和中枢神经系统，涉及到许多生理和病理变化如吗啡耐受和依赖等。我们利用前强啡肽基因（prodynorphin gene）构建pUC57-prodynorphin重组质粒为下一步探讨其在吗啡耐受和依赖中的作用奠定了基础。

SARS-CoV基因重组质粒的构建与表达

目的 针对SARS冠状病毒 (SARS CoV)M、N、S和E蛋白 ,构建 4种重组真核表达质粒pVAX1 M、pVAX1 N、pVAX1 S和pVAX1 E ,为研制SARSDNA疫苗奠定基础。方法 根据GenBank中SARS病毒基因序列分别设计M、N、S和E引物 ,用RT PCR方法从感染SARS病毒的Vero E6细胞中扩增得到M、N、S和E片段 ,构建重组质粒pVAX1 M、pVAX1 N、pVAX1 S和pVAX1 E。并以重组质粒转染COS 7细胞 ,用免疫细胞化学和Westernblot方法鉴定重组质粒体外的表达。结果 经酶切鉴定及DNA序列测定证实重组质粒构建正确 ,细胞转染实验表明 ,构建的 4种重组质粒均能在COS 7细胞内表达。结论 成功构建 4种SARS CoV 4种蛋白抗原真核表达质粒 ,并能在真核细胞内获得表达。

HBV-前C区反义基因真核表达重组质粒电穿孔转染2.2.15细胞转化方案的条件优化

目的 :探索最佳HBV 前C区反义基因真核表达重组质粒电穿孔转染 2 .2 .1 5细胞的转化条件。方法 :构建含HBV 前C区反义基因真核表达重组质粒后 ,通过控制质粒DNA浓度、电压、电容、时间、温度等实验条件进行电转染观察转染细胞生长情况。结果 :在电压 2 1 0V、电容 975uF、温度 4℃、DNA终浓度在 0 .1 2 5μg/μl至0 .75μg/μl之间时 ,细胞转染生长情况最佳。结论 :上述优化实验条件 ,可明显提高HBV 前C区反义基因真核表达重组质粒电穿孔 2 .2 .1

HSU17714基因反义重组质粒的构建及其对人大肠癌细胞生长的影响

我所应用减式杂交方法筛选人大肠癌负相关基因,得到一与已知基因同源性仅50％的cDNA片段,已作为新发现的基因被NCBI收录入国际基因库,我们将此cDNA片段反向克隆至非整合型哺乳动物表达载体pREP9的多克隆位点中,构建了HSU17714基因的反义RNA表达载体,并籍脂质体将之导入人结肠癌SW1116细胞中,双层软琼脂集落培养试验、流式细胞技术分析及MTT比色法等结果分别提示转染该重组体的肠癌细胞的非锚着依赖性生长能力、增殖周期活性和细胞生长速度均受到不同程度的抑制,说明外源重组体pREP9+HSU17714(AS)对肠癌SW1116细胞的生长具有抑制作用。

HPV 6b L1基因原核表达系统的构建及鉴定

克隆、构建人乳头瘤病毒6b型(HPV6b)L1基因重组质粒,并进行表达和鉴定。用PCR方法,从尖锐湿疣标本中扩增出HPV6b型L1基因,构建重组克隆质粒pblue-HPV6bL1,测序分析其基因变异。将本地株HPV6b型L1基因酶切后连接到原核表达质粒pBAD,构建原核表达系统pBAD-HPV6bL1/Top10,酶切鉴定证明重组质粒的正确性。经L-Arobinose诱导后表达HPV6b型L1蛋白,利用SDS-PAGE对表达产物进行鉴定。经酶切及序列分析鉴定,重组质粒pBAD-HPV6bL1构建成功,诱导后能够表达L1融合蛋白。HPV6bL1重组质粒构建成功,并获得HPV6bL1蛋白,为该蛋白的功能及HPV的基因工程疫苗研究提供了物质基础。

白细胞介素18基因工程表达方法

目的探讨人白细胞介素(IL)-18基因工程表达方法。方法复苏含有p GEX-IL-18重组体质粒的E.coli JM109,并进行增菌培养;利用质粒提取试剂盒提取p GEX-IL-18重组体质粒,通过琼脂糖凝胶电泳、基因片段测序、基因库比对等技术鉴定IL-18基因序列;将提取得到的p GEX-IL-18重组体质粒转化到DH5α,制成高效表达的IL-18原核表达系统。结果含有p GEX-IL-18重组体质粒的E.coli JM109增菌培养后提取质粒,酶切电泳与Marker比对,证实质粒大小2.7 kb;经测序并利用基因库比对证实,所制备的DNA片段符合IL-18基因序列。将p GEX-IL-18转染DH5α细菌内,并经过蓝白筛选系统进行筛选,证实转染成功。结论经过系统的实验研究,成功建立了IL-18的基因工程表达系统。IL-18具有重要的生物学功能,在后续的科研工作中将对IL-18的应用价值进行系统研究。

人胰岛素原基因B10位定点突变对增强胰外表达效率的实验研究

目的构建在肝细胞内增强表达成熟人胰岛素的生理调控性人胰岛素原基因重组质粒。方法利用PCR定点突变技术在B-C及C-A连接处已两点突变的人胰岛素原基因上进行B10位突变,并在其上游连接肝细胞特异的3倍体葡萄糖反映元件(GLRE3)和胰岛素样生长因子结合蛋白-1启动子(IGFBP-1P)。经酶切后将含有调控元件的3点突变人胰岛素原基因(GLRE3-IGFBP-1P-3mINS)插入逆转录病毒载体(pLXSN),脂质体介导转染大鼠肝癌细胞CBRH7919后检测成熟胰岛素表达情况及与含有调控元件的2点突变人胰岛素原基因(GLRE3-IGFBP-1P-3mINS)表达体的表达差异。结果人胰岛素原基因的B10位组氨酸编码序列CAC突变为门冬氨酸编码序列GAC。构建了含调控元件的B10位门冬氨酸人胰岛素原基因逆转录病毒载体质粒(pLXSN-GLRE3-IGFBP-1P-3mINS),酶切、PCR及测序鉴定各段基因碱基序列及连接方向正确。pLXSN-GLRE3-IGFBP-1P-3mINS经脂质体包裹转染大鼠肝癌细胞,细胞外液含5.0、25.0mmol/L的葡萄糖浓度下胰岛素含量分别为5.03±0.72、43.90±2.30mU/L。未进行B10位突变的重组体转染组在同样葡萄糖浓度下胰岛素含量分别为<2.00、2.10±0.23mU/L。结论成功构建了含调控元件的B10位门冬氨酸人胰岛素原基因逆转录病毒载体重组质粒,该重组体已整合入鼠肝癌细胞基因组,其表达效率显著提高并受葡萄糖生理性调控。

超极化激活环化核苷酸门控通道2基因转染后293T细胞中目的基因的表达

背景:研究证实超极化激活环化核苷酸门控通道电流在调控心脏的自发搏动中起着非常重要的作用。目的:观察超极化激活环化核苷酸门控通道2基因重组质粒转染后293T细胞中目的基因在核酸和蛋白质水平的表达。方法:采用脂质体转染试剂Lipofectamine2000将含全长超极化激活环化核苷酸门控通道2基因的质粒CMV-hHCN2-3xHA-IRES-EGFP转染至293T细胞中。结果与结论:用脂质体转染试剂Lipofectamine2000成功地将质粒CMV-hHCN2-3xHA-IRES-EGFP转染至293T细胞中。反转录PCR定性地检测到在100-250bp处可见高度特异DNA的条带,与携带超极化激活环化核苷酸门控通道2基因的质粒扩增出的片段位置相同。经过RT-PCR、Western-blot方法检测提示超极化激活环化核苷酸门控通道2基因在mRNA和蛋白水平都有高表达。表明质粒CMV-hHCN2-3xHA-IRES-EGFP成功转染后的293T细胞中超极化激活环化核苷酸门控通道2基因可以在核酸和蛋白水平表达。

α-突触核蛋白对酪氨酸羟化酶基因启动子的影响作用研究

目的：探讨α-突触核蛋白对多巴胺代谢的调节机制。方法：以人基因组DNA为模板，PCR法扩增酪氨酸羟化酶（Tyrosine Hydroxylase，TH）基因区部分DNA片段（＋25～-495bp），将其插入质粒pGL3-Basic，构建荧光素酶报告基因重组质粒pGIm—THprom，转染多巴胺能神经元细胞系MES23．5和MES23．5／hα-Syn^＋。结果：双荧光素酶活性分析表明，pGL3-basic、pGIm—THprom和pGL3-control在MES23．5细胞中表达的荧光素酶活性分别为5．60±0．67，26．80±4．11和32．90±4．75，而pGL3-THprom在MES23．5和MES23．5／hα-Syn＋中表达的荧光素酶活性分别为26．80±4．11和14．40±0．61。