生物反应器培养轮状病毒基因重配株Ls条件的优化

目的轮状病毒基因重配株Ls(G3型)在生物反应器微载体培养Vero细胞条件的优化。方法采用3 L生物反应器微载体培养Vero细胞,观察Ls株在不同病毒感染复数(0.001、0.002、0.010、0.040 MOI)、不同温度(34.5℃和35.5℃)、不同病毒收获时间(24和48 h)对病毒增殖的影响。根据病毒滴度和收获量筛选出最适MOI、培养温度及病毒的收获时间。结果以0.002 MOI接种Vero细胞,温度为34.5℃培养病毒,滴度最高达7.50 lg CCID50/m L;48 h可连续收获4次病毒液,且收获总量及病毒滴度均高于24 h。结论通过对Ls株在生物反应器微载体Vero细胞培养条件的优化,获得的病毒液滴度高及连续培养多次收获量增加的有效方法,为进一步规模化培养奠定了基础。

轮状病毒基因重配株血清型鉴定方法的研究

Ａ组轮状病毒中根据基因９的不同目前至少已发现有１３个不同Ｇ血清型，其中能引起人类致病的有Ｇ１－Ｇ４，Ｇ８，Ｇ９和Ｇ１２型。建立可靠的血清型鉴定技术对于轮状病毒疫苗的研制和分子流行病学的研究具有重要意义。本文首次报导了一种鉴定轮状病毒Ｇ血清型的新方法，利用已知有关轮状病毒ＶＰ７基因的序列资料，设计合成了一套鉴定轮状病毒Ｇ血清型的寡核苷酸探针，利用地高辛标记上述探针。待检品经反转录ＰＣＲ扩增后与上述一套寡核苷酸探针分别进行杂交得以确定其血清型。这一方法与目前常用的套式ＰＣＲ方法相比更适合于大量样品的操作而且结果可靠。用这一方法对本实验室组建的四株基因重配疫苗株进行实验，其结果与套式ＰＣＲ方法完全一致。

轮状病毒基因重配株LD_9(G_2型)Vero细胞适应株的选育及其生物学特性

目的探讨轮状病毒基因重配株LD(9G2型)在Vero细胞上的传代适应性,选育高滴度的适应株。方法将3个轮状病毒基因重配株LD9克隆株(G2型)(LD9-1、LD9-2、LD9-3)在Vero细胞上分别以0.05、0.10、0.15和0.20MOI传代,选育出1株Vero细胞适应株,并确定其最适MOI,然后在Vero细胞上连续传代15代,检测病毒滴度及基因组核酸带型,采用nestRT-PCR法扩增其VP7基因。取第8、10、13代适应株病毒,以0.10MOI接种于Vero细胞,观察病毒的增殖动态。结果选育出的LD9-2株以0.10MOI接种Vero细胞可产生明显的细胞病变(CPE),病毒滴度随传代次数的增加先下降后升高,至4代时最低,9代后稳定于6.75lgCCID50/ml左右;连续传代15次,病毒基因组核酸带型均与原始毒株一致,且均能扩增出502bp的VP7基因。LD9-2株病毒增殖高峰期均出现在第7～8天,病毒滴度为6.00～7.00lgCCID50/ml。结论轮状病毒基因重配株LD9株(G2型)经Vero细胞适应性培养,获得了病毒表达量高且能稳定传代的疫苗候选株。

轮状病毒基因重配LH9株(G4型)传代稳定性研究

对兰州生物制品研究所自行构建的轮状病毒基因重配株G4型LH9株在Vero细胞中传代的稳定性进行研究。将基因重配LH9毒株接种于Vero细胞上从7代传至17代,经电镜检查、病毒滴度测定、病毒基因组RNA电泳图谱分析、基因序列测定分析、轮状病毒型别鉴定及其它相关检定,结果均符合药典要求。证实该毒株为A群G4P〔12〕型轮状病毒,在Vero细胞传代中具有良好的稳定性,为疫苗研制提供安全有效的依据。

轮状病毒LH9株在Vero细胞中的培养条件优化研究

为优化轮状病毒株在Vero细胞上的培养条件,将轮状病毒基因重配株LH9按0.1MOI分别接种于不同规格的细胞培养瓶(100ml、2000ml、3L、15L)。病毒接种采用吸附与未吸附两种方式、病毒收获采取低温冻融后离心与直接离心两种方法,观察分析对病毒滴度的影响。实验中,用CASY细胞计数仪分析活细胞率,病毒接种后逐日观察细胞病变(CPE)并取样,采用细胞半数感染量测定病毒滴度。结果表明,使用不同规格细胞培养瓶经吸附法培养接种、低温破碎法收获的LH9株病毒滴度高,其中以15L立瓶培养滴度最高(6.0～7.0 logCCID50/ml)。

口服人-牛(WC_3株)5价轮状病毒基因重配活疫苗保护效果的Meta分析

目的评价口服人-牛(WC_3株)5价轮状病毒基因重配活疫苗(PRV)的保护效果。方法检索中国生物医学文献数据库等中文数据库和美国国家医学图书馆数据库等外文数据库,检索有关PRV保护效果的研究纳入分析。按照研究地区的社会经济发展水平、疫苗株和流行株的匹配情况,分别合并试验组和对照组针对不同型别轮状病毒感染引起的急性肠炎发病的相对危险度(RR)或比值比(OR),计算疫苗效力(VE)。结果共纳入5篇病例对照研究。高发展水平国家,在疫苗株和流行株完全匹配的情况下,VE=94%(95%CI:84%~98%);在疫苗株和流行株不完全匹配的情况下,VE=82%(95%CI:70%~89%);在单一抗原匹配的情况下,VE=82%(95%CI:70%~89%);在单一抗原不匹配的情况下,VE=75%(95%CI:47%~88%)。中等发展水平国家,在疫苗株和流行株不完全匹配的情况下,VE=37%(95%CI:10%~56%);在单一抗原匹配的情况下,VE=71%(95%CI:60%~78%);在单一抗原不匹配的情况下,VE=76%(95%CI:61%~85%)。结论接种PRV可降低轮状病毒感染引起的急性肠炎发病率,PRV的保护效果与疫苗株和流行株匹配情况以及地区因素有关。

有限稀释法筛选轮状病毒LD9株纯化方法的建立及应用

目的:建立有限稀释法克隆纯化轮状病毒的试验方法,筛选出感染性强、遗传特性稳定的轮状病毒基因重配株LD9。方法:梯度稀释LD9毒种,用5个稀释度(10-4～10-8)的病毒感染铺满单层Vero细胞的96孔板细胞,培养6 d,-20℃冻融,培养物传代至24孔板继续培养6 d,显微镜下观察细胞病变(CPE),-20℃冻融后检测。以相同方法重复克隆纯化3次,筛选获得病毒滴度稳定、具有稳定遗传特性的纯化病毒,由T25、T75到2,4,10层细胞工厂逐级放大培养。结果:筛选出适用于疫苗生产用的遗传特性稳定、感染性强的LD9疫苗候选株。结论:建立了适用于轮状病毒克隆纯化的筛选方法。