一个革命性的抗癌研究策略:癌症的靶向基因-病毒治疗

2001年,笔者提出了癌症的靶向基因-病毒治疗(cancer targeting gene-viro-therapy,CTGVT)的概念,即将一个抗癌基因插入到溶瘤病毒(oncolytic virus,OV)中,从而将基因治疗与溶瘤病毒各自的优势结合起来,由于溶瘤病毒能大量复制,插入其中的基因也能大量复制,故其抗肿瘤效果大增,较单用基因治疗或OV治疗强数十至上百倍。随后又引入双基因策略(CTGVT-DG),即向OV载体插入两个抗癌基因,由于两个抗癌基因之间可能存在互补或协同效应,在一些动物癌症模型中几乎能杀灭全部移植性肿瘤。近年来又采用纳米粒子把CTGVT-DG病毒颗粒包被,或者采用溶瘤痘病毒(OncoPox)作为载体与CTGVT-DG策略相结合,后者将可构建一系列抗癌作用极好的双基因OncoPox-gene1-gene2产物。国外多数使用OV-GM-CSF策略,仅局限于GM-CSF的免疫功能,忽视了基因复制的剂量效应及其重要性,这就是中国的CTGVT-DG胜过西方的优势之处。

基因-病毒治疗系统CNHK300-murine endostatin的构建及体外研究

目的构建一种新型的肿瘤基因-病毒治疗系统CNHK300-murine endostatin(CNHK300-mE),以肿瘤增殖病毒为载体,携带抗肿瘤新生血管生成的基因。方法利用基因重组技术将人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子插入腺病毒E1A基因上游,将小鼠内皮抑素基因表达盒插入到腺病毒包装信号和hTERT启动子之间,通过病毒增殖试验、电镜技术、Western blot分析、酶联免疫吸附实验(ELISA)、鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)试验,观察CNHK300-mE的复制情况、mE的表达情况及对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管的抑制情况。结果成功构建了基因-病毒治疗系统CNHK300-mE,该系统为hTERT启动子调控腺病毒E1A基因表达并携带小鼠内皮抑素基因的重组腺病毒。该病毒可以在端粒酶阳性的胃癌细胞株SGC-7901和肝癌细胞株HepGII中大量增殖及复制,而在端粒酶阴性的正常纤维细胞中不增殖。电镜证实该重组病毒在胃癌细胞株SGC-7901中复制及增殖。ELISA检测表明SGC-7901感染CNHK300-mE后7d,小鼠内皮抑素的表达量为1000μg/L。CAM实验证实该病毒感染胃癌细胞后的培养液上清具有抗新生血管生成的生物活性。结论基因-病毒治疗系统CNHK300-mE能在端粒酶阳性的肿瘤细胞中特异性增殖复制,并大量表达具有抗新生血管生成生物活性的小鼠内皮抑素。

基因-病毒治疗系统CNHK300-murine endostatin治疗肝癌的实验研究

目的 探讨一种新的基因 病毒治疗系统CNHK30 0 murineendostatin(简称CNHK30 0 mE)对肝癌的治疗作用。方法 利用基因重组技术构建一种用人端粒酶逆转录酶 (hTERT)启动子控制腺病毒E1A基因表达并携带内皮抑素基因的基因 病毒治疗系统 ;通过 5 0 %组织培养感染剂量 (TCID5 0 )方法和细胞活性检测法四氮唑盐比色试验 (MTT法 )观察CNHK30 0 mE在 2种肝癌细胞株 (HepGII及Hep3B)及 1株正常的成纤维细胞株 (MRC 5 )中的病毒增殖能力和对细胞的杀灭能力 ;通过肝癌SMMC772 1细胞裸鼠皮下移植瘤模型观察该病毒对肝癌生长和对肿瘤血管生成的抑制作用 ;利用Western印迹法和酶联免疫吸附实验 (ELISA)法检测内皮抑素基因在体内和体外的表达。结果分别感染肝癌细胞株和正常细胞株 96h后病毒的增殖倍数相差 32 96倍 ,其达到半数杀伤量 (ED50 )时的感染复数 (MOI)值相差 2 5倍 ,差异有显著意义 ,且两者均明显优于ONYX 0 15 ;CNHK30 0 mE能明显抑制肝癌皮下移植瘤内血管的生成 ,对肿瘤生长的抑制作用与携带同一治疗基因的非增殖型腺病毒和不携带治疗基因的增殖型腺病毒ONYX 0 15相比均增强 (P均 <0 0 1) ;其所介导的内皮抑素基因在体内和体外的表达量均与携带该基因的非增殖型腺病毒载体相比均增高 (P <0 0

肿瘤治疗新策略：基因-病毒治疗

癌症的基因治疗，虽有进入临床Ⅲ期的项目，但无重大突破。近来，美国ONYX药物公司采用改造过的腺病毒(ONYX-015)与化疗相结合，治疗30例难治性头颈部癌症患者，其中8例完全缓解，11例肿瘤缩小一半以上，总有效率63％，这是迄今最为有效的肿瘤生物治疗的临床报告。故我们倡导基因治疗与病毒治疗相结合的策略(即基因-病毒治疗策略)，争取能获得更好的疗效。

溶瘤腺病毒靶向治疗恶性肿瘤研究进展

恶性肿瘤是当今世界严重威胁人类健康的疾病,也是人类生命的主要"杀手"之一。传统的放、化疗及手术治疗存在抗肿瘤能力低、杀伤指数过小、副作用大极易复发等缺点,对很多中晚期肿瘤患者往往缺少合适的治疗手段,因此,开发安全高效的生物治疗方法已成为肿瘤治疗领域关注的热点。基因-病毒治疗即是其中之一,它是将基因通过载体转入患者体内,从而达到治疗和预防肿瘤的目的。溶瘤腺病毒作为基因治疗的一种常用载体,在肿瘤治疗方面有着自生的优点和长处。本文简单对这一领域的研究进展进行综述。

溶瘤腺病毒SG7605-11R-P53对肝癌细胞的体外杀伤作用

目的：研究携带细胞穿膜肽11R和P53的溶瘤腺病毒SG7605-11R-P53对肝癌细胞的体外杀伤作用。方法：以本课题组前期实验构建的携细胞穿膜肽11R和P53的溶瘤腺病毒SG7605-11R-P53和不携11R的溶瘤腺病毒SG7605-P53感染肝癌细胞HepG2、SMMC-7721、Hep3B、Huh7和正常成纤维细胞株BJ,Western blotting检测感染后细胞P53和11R-P53的表达情况,TCID50法检测SG7605-11R-P53和SG7605-P53在肝癌细胞中的增殖能力,MTT法检测SG7605-11R-P53对肝癌细胞及正常细胞的杀伤作用。结果：SG7605-11R-P53和SG7605-P53能在肝癌细胞中高表达P53和11R-P53蛋白。SG7605-11R-P53可在HepG2、SMMC-7721、Hep3B和Huh7细胞中大量增殖,其增殖倍数是SG7605-P53的10100倍,但在正常BJ细胞内几乎不增殖。SG7605-11R-P53在MOI=0.1时对Hep3B细胞的杀伤率达90%,对于正常BJ细胞只有当MOI=50时才有很弱的抑制作用;SG7605-11R-P53对4种肝癌细胞杀伤作用的大小依次为Hep3B、HepG2、Huh7和SMMC-7721细胞。结论：携带细胞穿膜肽11R和P53的SG7605-11R-P53溶瘤腺病毒体外对4种肝癌细胞株均有较好的靶向杀伤作用,尤其对Hep3B细胞的杀伤作用最强。

携带Kallistatin的溶瘤腺病毒载体构建及其对肝癌细胞的体外杀伤效应

采用靶向基因-病毒治疗策略,通过同源重组的方式构建了携带Kallistatin(KAL)的重组溶瘤腺病毒ZD55-KAL,并研究其对肝癌细胞的杀伤作用。通过PCR方法鉴定病毒构建正确;MTT法检测病毒对肝癌细胞的杀伤能力和对正常细胞的安全性;结晶紫染色观察细胞凋亡现象。结果显示:经目的病毒ZD55-KAL感染后肝癌细胞出现明显的病变和生长抑制,而正常细胞未出现病变现象,表明目的病毒具有较高的安全性和对肿瘤细胞的特异性杀伤能力。此外ZD55-KAL感染肝癌细胞后引起凋亡,所携带的治疗基因KAL能通过促进肿瘤的凋亡达到抑制肿瘤细胞生长的效果。

新型的病毒-基因治疗系统CNHK500-hγ的构建

目的研制出一种新的基因-病毒治疗系统。方法通过基因操作技术将主要晚期启动子(MLP)调控的人干扰素-γ基因插入腺病毒E1A基因受hTERT启动子调控、E1B基因受HRE启动子调控的增殖病毒载体质粒PXC70-HRE-TP的E1A上游,得到腺病毒质粒pSG500-hγ。通过pSG500-hγ与质粒pBHGE3在293细胞中同源重组得到重组病毒CNHK500-hγ。用TCID50方法测定病毒滴度。通过增殖实验观察重组病毒的选择性增殖能力。利用ELISA法检测人干扰素-γ抗癌基因的表达。结果CNHK500-hγ的病毒滴度为4×109pfu/ml,增殖实验结果证实CNHK500-hγ可以选择性地在端粒酶阳性的肝癌细胞中增殖,CNHK500-hγ所携带的人干扰素-γ基因在肝癌细胞株中的表达量(442μg/L)明显高于携带该基因的非增殖型腺病毒载体(120μg/L)Ad-hγ(P<0.005)。结论CNHK500-hγ是一种具备治疗肝癌潜力的新型基因-病毒治疗系统。

肝癌选择性溶瘤腺病毒的构建及其体外抑瘤作用

目的:构建由AFP基因增强子-启动子调控,并携带自杀基因TK的新型条件复制型腺病毒载体,观察该载体的选择复制能力、溶瘤作用及其与前药GCV联合处理对肝癌细胞的杀伤作用。方法:以HepG2基因组DNA为模板,PCR扩增AFP基因启动子(AFPp)和增强子(AFPe),构建表达质粒pAFPp-EGFPluc和pAFPep-EGFPluc,再构建由AFPep调控E1A表达、并携带TK基因的穿梭质粒pDC311-AFPep-E1A/CMV-TK,利用AdMax系统包装腺病毒Ad.AFPep-E1A/CMV-TK;利用Western blotting、病毒增殖测试、细胞病变效应实验、病毒联合前药GCV对肝癌细胞的杀伤实验等鉴定病毒的复制能力、溶瘤作用和对肝癌细胞的杀伤作用。结果:成功构建的腺病毒载体Ad.AFPep-E1A/CMV-TK在AFP阳性细胞中选择性复制,病毒自身具有一定的溶瘤作用;该病毒载体联合GCV前药系统处理肝癌细胞后,AFP阳性肝癌HepG2细胞和Hep3B细胞的存活率分别为(10.35±1.07)%、(15.49±5.80)%,AFP阴性的张氏肝细胞和人肺癌NCIH460细胞的存活率分别为(73.55±4.36)%、(74.54±9.89)%(P<0.01)。结论:构建的新型溶瘤腺病毒载体具有选择性杀伤肝癌细胞的能力,在肝癌治疗方面有良好的应用前景。

基因改造的溶瘤痘病毒在肿瘤治疗中的研究进展

目前,肿瘤的标准治疗包括手术、放射疗法、化学疗法、温热疗法和生物/免疫疗法。溶瘤病毒治疗,即利用病毒的复制能力,选择性感染和破坏肿瘤细胞,同时保留正常细胞和组织,是肿瘤生物/免疫治疗的一个新疗法。基因治疗一直是肿瘤生物治疗的重要策略,利用基因工程策略在溶瘤病毒载体上插入抗癌基因,将病毒治疗与基因治疗有机结合,成为具有很强杀伤作用的基因–病毒治疗手段。近年来,以溶瘤痘病毒为载体的肿瘤基因治疗受到较多关注,通过基因工程策略对痘病毒进行改造是提高其抗肿瘤作用的重要策略。目前,用于基因工程改造的溶瘤痘病毒主要有Wyeth株、WR(Western Reverse)株、Lister株、Copenhagen株和天坛株。该文就目前对痘病毒进行基因工程改造的常见形式以及经基因工程改造的痘病毒用于治疗肿瘤的研究进展作一综述。

癌症基因治疗技术进展与展望

癌症是严重危害人类健康的重大疾病之一,寻找高效可行的癌症治疗方法一直是医学研究的重要课题。继外科手术、放疗、化疗、免疫治疗之后,随着人们对基因组学的深入了解及分子生物学技术的不断发展,基因治疗作为一种全新的治疗理念已被证明具有显著临床疗效及优势。对癌症基因治疗的原理及几种新技术的应用进行介绍,并对基因治疗未来在临床上的应用加以展望。

Survivin介导的条件复制型溶瘤腺病毒表达IL-24蛋白对人肝癌细胞PLC作用机制探究

条件复制型溶瘤腺病毒Ad.sp-E1A_((△24)-IL-24对人肝癌细胞株PLC的作用机制尚不清楚。采用流式细胞仪检测PLC经PBS、Ad.sp-E1A_((△24)以及Ad.sp-E1A_((△24)-IL-24处理48h后细胞周期的变化;利用Western blot检测PLC经PBS、Ad.sp-E1A_((△24)以及Ad.sp-E1A_((△24)IL-24处理24 h、48h后细胞中凋亡信号相关蛋白表达量的变化。实验结果表明:Ad.sp-E1A_((△24)和Ad.sp-E1A_((△24)-IL-24能将PLC细胞周期阻滞在S期,其值分别为43.74%±6.61%,49.48%±7.60%,两者与未感染病毒的对照组(18.91%±1.83%)进行统计学差异分析,P值均<0.05;同时,Western blot检测发现随着处理时间的增加,病毒处理组中CHOP的表达量、caspase 12的剪切水平及STAT3、p38 MAPK的磷酸化水平都有明显提高,尤其以Ad.sp-E1A_((△24)-IL-24处理组较为明显。SOCS3的表达量病毒处理组与对照组没有显著差异。上述结果表明重组腺病毒Ad.sp-E1A_((△24)-IL-24能有效阻滞PLC细胞周期在S期,并可能通过内质网压力、STAT3与MAPK信号通路等多种途径诱发PLC细胞凋亡。

内皮抑素和血管生成抑素融合基因的裂解病毒对C6胶质瘤的实验研究

目的探讨重组单纯疱疹病毒介导的内皮抑素和血管生成抑素（Endo-Angio）融合基因对C6胶质瘤的疗效。方法构建含有Endo-Angio融合基因的重组单纯疱疹病毒，四唑蓝比色法（MTT法）体外观察其C6细胞的裂解作用；Western-blot观察Endo—Angio融合蛋白的表达。建立大鼠C6模型，当肿瘤体积≥2mm^3时，治疗组瘤腔内注射10^7pfu（10μl）病毒，对照组注射等剂量生理盐水。MRI动态观察肿瘤体积变化，组织病理行微血管计数，并记录荷瘤鼠生存时间。结果体外实验示：当感染率（MOI）=1000时，99％的C6细胞死亡；头部MRI发现治疗组胶质瘤生长减慢；荷瘤鼠存活期：对照组（20．3±0．45）d，治疗组（38．3±0．96）d，中位生存期延长（P〈0．01）；HE染色见瘤细胞分散，体积较小，无出血坏死；病理染色示：治疗组和对照组新生血管均值分别为（5．3±1．7）／HP和（15．6±2．8）／HP（P〈0．01）。结论重组单纯疱疹病毒介导的Endo-Angio融合基因不仅通过抑制肿瘤的新生血管生成，而且通过裂解肿瘤细胞双重作用治疗颅内胶质瘤。

内皮抑素和血管生成抑素融合基因修饰的单纯疱疹病毒对胶质瘤干细胞的体外实验研究

目的探讨内皮抑素和血管生成抑素（Endo—Angio）融合基因修饰的单纯疱疹病毒（VAE）对胶质瘤干细胞（GSCs）的体外溶瘤作用。方法新鲜高级别（WHOⅢ级、Ⅵ级）人脑胶质瘤标本经原代培养获得GSCs，采用流式细胞术检测其中CD133阳性细胞数，单克隆形成实验检测GSCs的自我更新能力，免疫荧光技术检测未分化GSCs的Nestin及分化后GFAP、NF和MAG的表达；MTS法检测VAE对GSCs增殖活性的影响，RT—PCR和Western blot检测Endo—Angio融合蛋白的表达并检测其对人脑微血管内皮细胞（HBMEC）增殖的影响；最后观察病毒处理后仍存活细胞的自我更新和诱导贴壁情况。结果（1）从20例高级别胶质瘤标本中培养出4例GSCs，能够表达CD133及Nestin，具有自我更新能力和多向分化能力。（2）VAE能够感染GSCs，4例GSCs增殖活性明显下降（P〈0．05）。（3）VAE感染GSCs 48h后，基因水平及蛋白水平都有Endo—Angio融合蛋白表达，该融合蛋白使HBMEC增殖活性明显下降（P〈0．05）。（4）VAE感染后仍存活的细胞不再具有形成GSCs球的能力，加入血清诱导后也不再贴壁生长。结论在体外，VAE能够显著抑制GSCs活性，能够表达具有生物活性的Endo—Angio融合蛋白，为脑胶质瘤溶瘤病毒治疗开辟了新的途径。

综述列题

肿瘤休眠及其机制研究进展；癌症的靶向基因-病毒治疗新进展及抗癌策略；补体调节蛋白CD46、CD55及CD59在肿瘤免疫治疗中的研究进展；高密度全基因组单核苷酸多态芯片研究进展及其在肿瘤研究中的应用；靶向P13K-Akt-mTOR信号通路抑制剂的研究进展。

A33启动子结肠癌特异性探究及SV40增强子对其转录活性影响

为了探究A33核心启动子结肠癌特异性及SV40增强子对其转录水平的影响,该研究通过构建A33核心启动子和带SV40增强子的A33核心启动子(eA33)的荧光素酶报告基因载体pGL3-A33和pGL3-eA33,与内参照pRL-SV40质粒共转染至不同的细胞系中,利用双荧光素酶检测系统检测分析了A33和eA33启动子在不同细胞系中的转录活性。结果显示,A33核心启动子在结肠癌细胞系中具有转录活性低,但结肠癌特异性好的特点,而在其他类型癌细胞中基本没有活性。同时发现,eA33在各类癌细胞中的转录水平与A33相比,均呈大幅度提高,有显著性差异(P<0.01),但SV40增强子能显著增强A33启动子转录活性的同时减低了其结肠癌特异性。这为靶向癌症基因—病毒治疗策略在结肠癌的生物治疗应用中寻找结肠癌特异性的启动子奠定了研究基础。