PRRSV、基因2型CSFV、PRV和JEV一步法多重RT-PCR检测方法的建立

为了建立一种快速鉴别PRRSV、基因2型CSFV、PRV和JEV的一步法多重RT-PCR检测方法,试验分别以PRRSV ORF6基因、基因2型CSFV E2基因、PRV gE基因和JEV E基因为靶基因构建重组核酸标准品;设计4对特异性检测引物,在同一反应体系中对One-step RT-PCR Enzyme Mix浓度、引物浓度和退火温度等进行优化,检验特异性、敏感性和重复性;用建立的一步法多重RT-PCR检测方法与商品化试剂盒同时对已知临床样本[35份PRRSV、45份CSFV、20份PRV(gE)和25份JEV阳性核酸和20份阴性核酸样本]进行检测,比较符合率。结果表明:经反应条件的优化确定一步法多重RT-PCR检测方法的最佳扩增体系[5×QIANGEN One-step RT-PCR Buffer 10μL,dNTP Mix 2μL,One-step RT-PCR Enzyme Mix(20 U/μL)2μL,上下游引物(基因2型CSFV、JEV引物浓度均为5μmol/L,PRRSV引物浓度为3μmol/L,PRV引物浓度为7μmol/L)各1μL,模板1μL,DEPC水补足至50μL]和扩增程序[50℃30 min;95℃15 min;94℃30 s,58℃30~45 s(基因2型CSFV、PRRSV 30 s,PRV、JEV 45 s),72℃1 min,共循环35次;72℃10 min]。该方法对基因1型CSFV毒株(Shimen株)、CSFV疫苗株(HCLV株)、PRV疫苗株、BVDV及9种猪常见病毒和细菌病原均未检出;对PRRSV、基因2型CSFV、PRV和JEV核酸标准品检测下限分别为1.72×10^(2) copies/μL、1.97×10^(3) copies/μL、1.94×10^(3)copies/μL和2.08×10^(2) copies/μL;该方法具有良好的重复性;与商品化试剂盒检测结果的符合率分别为PRRSV 100%(k=1)、基因2型CSFV 96.9%(k=0.93)、PRV 100%(k=1)和JEV 100%(k=1)。说明本研究建立了一种能同时检测PRRSV、基因2型CSFV、PRV(gE基因)和JEV的快速、精准和高效的一步法多重RT-PCR检测方法,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。