人类抗凋亡基因bcl-xL的克隆及其在大鼠心肌细胞内的高效表达

【目的】克隆人类抗凋亡基因 bcl-xL cDNA,构建两种不同的真核表达载体,评价大鼠心肌细胞表达外源性bcl-xL 的效果,并比较不同转染方法对 bcl-xL 表达的影响。【方法]】RT-PCR 法从人肝脏组织获取 bcl-xL cDNA,连接至pTargeT^(TM)载体,并亚克隆至真核表达载体 pEGFP-C1上;细菌内同源重组构建重组腺病毒质粒,腺病毒纯化试剂盒获取高滴度的重组腺病毒;脂质体和腺病毒介导分别转染体外培养的大鼠心肌细胞,荧光显微镜观察转染效率,RT-PCR 和免疫细胞化学染色法检测 bcl-xL mRNA 和 bcl-xL 蛋白的表达。【结果】获取的 bcl-xL cDNA 测序正确,成功克隆真核表达质粒 pEGFP-bcl-xL;病毒颗粒滴度高达5.3×10^(12)pfu/L;脂质体和腺病毒转染心肌细胞效率分别为40.3%和95.4%,转染后bcl-xL mRNA 和 bel-xL 蛋白的表达均增加,但两种方法之间差异有统计学意义(P<0.01)。【结论】成功获取人类 bcl-xL基因并制备真核表达质粒和重组腺病毒,心肌细胞能高效表达外源性 bcl-xL,并以腺病毒介导更为理想。为 bcl-xL 基因治疗缺血性心脏病提供实验基础。

凋亡相关基因bcl-xl在乳腺癌中的表达

为了探讨凋亡相关基因bcl-xl在乳腺癌中的表达及其临床意义，本文采用免疫络化SABC法和原位末端标记（TUNEL）法，分别对68例浸润性乳腺癌原发灶中bcl-xl蛋白及细胞调亡指数进行了检测。结果表现：bcl-xl蛋白在不同病理类型、年龄及临床分期中的阳性表达率无统计学差异（P＞0．05）；但在腋转移淋巴结＜4个组和≥4个组的阳性表达率分别为45％和71．4％（P＜005）；bcl-xl蛋白明性组和阳性组的平均凋亡指数分别为0．32％和0．18％（P＞0．05）。提示：bcl-xl蛋白与腋淋巴结转移有关，有可能作为乳腺癌预后判断的一个指标。

人bcl-xl转基因小鼠外源基因的复制及传代的稳定性观察

显微注射法建立转 bcl- xl基因小鼠 ,将 PCR及 Southern- blot检测阳性的小鼠与正常鼠交配并传代 ,然后检测子代中外源基因的遗传情况。结果发现 :10号小鼠传代过程中 PCR阳性率保持稳定 ,符合孟德尔遗传规律 ,外源基因能够稳定遗传。 6号小鼠 PCR阳性率呈轻微下降趋势 ,但能够保持相对稳定遗传。 13号和 5号小鼠 PCR阳性率均呈现明显的下降趋势。该二小鼠存在外源基因遗传丢失现象。结果提示

细胞色素C对HL-60细胞促凋亡作用及其对bcl-2、bcl-xl基因表达的影响

目的:探讨细胞色素C在体外作用于HL-60细胞时细胞发生的变化及其相关凋亡基因bcl-2、bcl-xl表达变化的机制。方法:用不同浓度的细胞色素C作用于HL-60细胞24h,然后用MTT检测细胞色素C对HL-60细胞抑制率;用普通光镜、荧光显微镜检测HL-60细胞形态的变化;用流式细胞仪、DNA凝胶电泳对HL-60细胞凋亡的检测;用RT-PCR检测bcl-2、bcl-xlmRNA表达的变化。结果:细胞抑制率随着细胞色素C浓度的增加而增加;当细胞色素C浓度在0-37·5mg/L作用HL-60细胞24h,随着细胞色素C浓度的增加,HL-60细胞发生的凋亡逐渐增加,可见典型的凋亡细胞和明显的DNA梯度条带;同时,在该浓度范围内,bcl-2、bcl-xlmRNA表达逐渐减少;当细胞色素C浓度大于37·5mg/L时,细胞凋亡率并不增加,而是下降,但是坏死细胞明显增加。结论:一定浓度细胞色素C能诱导HL-60细胞发生凋亡,并且细胞凋亡率、bcl-2、bcl-xl基因表达的变化与细胞色素C浓度呈一定的量效依赖关系,细胞色素C诱导HL-60细胞凋亡可能与抑制bcl-2、bcl-xl基因的表达有一定的关系。

bcl-xL基因介导白血病细胞多药耐药的形成

目的 观察 bcl- x L 基因可否介导白血病细胞的多药耐药 ,并探讨其机制 .方法 采用脂质体法将 bcl- x L c DNA转导入 HL- 6 0细胞 ;免疫印迹法检测 Bcl- x L 及抗凋亡蛋白Bax的表达 ;MTT法测定足叶乙甙、柔红霉素、阿霉素对转染细胞的细胞毒性 ;流式细胞仪定量检测凋亡细胞及细胞内药物浓度 .结果 Bcl- x L高表达可抑制足叶乙甙诱发的凋亡 ,抑制率为 40 .5 % ;降低上述化疗药物的细胞毒作用 ,耐药指数分别为 3.2 ,3.2 ,1 .6 ;但细胞内柔红霉素药物浓度无改变 .结论 Bcl- x L可能作为一种新的耐药途径 ,通过抑制化疗药物诱发的细胞凋亡参与多药耐药的形成 .

Bcl-xL基因在正常皮肤血管组织、增生及退化期血管瘤组织中的表达

背景:有文献报道Bcl-xL基因能抑制细胞凋亡,并可能参与血管形成,但目前Bcl-xL基因在恶性肿瘤中的研究较多,而在血管瘤的研究较少。目的:应用免疫组织化学染色法检测增生期和退化期血管瘤和正常皮肤血管组织中Bcl-xL基因的表达。方法:收集有完整临床和病理资料的40例皮肤血管瘤手术切除标本,包括增生期血管瘤22例,退化期血管瘤18例。另取瘤组织周围正常皮肤组织5例作为对照。采用免疫组织化学染色方法检测Bcl-xL在各组中的表达,并结合Ⅷ因子相关抗原的免疫组织化学染色证实表达Bcl-xL阳性表达的细胞为血管瘤组织中的内皮细胞,并测定Bcl-xL在各组中的平均吸光度和平均阳性面积率。结果与结论:增生期血管瘤内皮细胞胞浆内可见较多的棕黄色颗粒沉积,Bcl-xL表达呈强阳性;退化期血管瘤和正常皮肤组织内皮细胞胞浆内可见少量的棕黄色颗粒或无棕黄色颗粒,Bcl-xL表达弱或无表达。增生期血管瘤与退化期血管瘤和正常皮肤组相比,Bcl-xL阳性表达的平均吸光度和阳性面积率明显增高(P<0.01)。结果显示,Bcl-xL为抗凋亡基因,在增生期时呈高表达,其促进了血管内皮细胞的增殖,参与了血管瘤的增生。

非霍奇金淋巴瘤BCL-XL基因表达及突变的研究

本研究探讨78例非霍奇金淋巴瘤BCL-XL表达和突变的发生率及其临床意义。应用激光微切割技术从淋巴结组织中特异地分离淋巴瘤细胞,用实时定量RT-PCR法检测淋巴瘤组织和淋巴瘤细胞中BCL-XL的表达,PCR直接测序法检测BCL-XL的突变情况。结果表明:与淋巴结反应性增生(15例)相比,滤泡性淋巴瘤(30例)组织和微切割的淋巴瘤细胞均高表达BCL-XL(P值分别为0.0064和<0.0001),而T细胞淋巴瘤(24例)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(24例)中BCL-XL表达无明显升高。在滤泡性淋巴瘤中,BCL-XL高表达的患者常伴多个淋巴结外器官累及(P=0.0004),血清乳酸脱氢酶水平升高(P=0.0019),国际预后指数分组多为高危组(P=0.0013),患者总生存期短(P=0.0451)。突变检测发现1例滤泡性淋巴瘤BCL-XL的同义突变(密码子109ACA→ACC)。结论:BCL-XL表达与滤泡性淋巴瘤的疾病进展和患者预后密切相关。

建立转bcl-xL基因小鼠的研究

目的 建立转 bcl- x L 基因小鼠 ,继而传代建系 ,用于缺血性脑血管疾病的研究。方法 采用显微注射法 ,将人 bcl- x L 基因注入昆明小白鼠受精卵获得子代鼠 ,然后作 PCR、Southern- blot、m RNA、Western- blot检测以获得阳性鼠。结果 实验中注射受精卵 16 5 4枚 ,移植卵数 14 4 8枚 ,受体鼠 4 9只 ,怀孕鼠 7只 ,子代鼠 13只 ,整合 4只并均有表达。注射受精卵的存活率 87.5 4 % ,受精卵的总存活率 0 .78% ,受体鼠的怀孕率 14 .2 8% ,整合效率 30 .77% ,总有效率为 0 .2 4 %。结论 获得了转 bcl- x L 基因小鼠 ,但转基因的效率较低 。

Bcl-xl和p53基因在条斑紫菜多糖抑制胃癌BGC-823细胞增殖中的作用

目的:探讨Bcl-xl、p53基因在条斑紫菜多糖抑制BGC-823细胞增殖和诱导凋亡中的作用。方法:将不同浓度条斑紫菜多糖作用于BGC-823细胞,利用MTT法检测细胞增殖抑制率,RT-PCR法检测Bcl-xl、p53基因表达量的变化、流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡情况。结果:条斑紫菜多糖能抑制BGC-823细胞增殖及诱导细胞凋亡,并上调p53和降低Bcl-xl表达。结论:条斑紫菜多糖抑制人胃癌细胞增殖、促进凋亡,其机制可能与激活p53、抑制Bcl-xl表达有关。

p53基因、Bcl-xL基因表达对淋巴性肿瘤细胞株辐射敏感性的影响

本文运用 PCR- SSCP银染法检测人淋巴细胞恶性肿瘤株 82 2 6、U2 66、Raji、Jurkat、Daudi p53基因状态 ,RT- PCR半定量检测 Bcl- x L的 m RNA的相对表达 ,DNA片段释放法检测细胞受照后 2 4 h的细胞 DNA链断裂量 ,探讨了 p53基因功能状态及 Bcl- x L基因表达对细胞株 82 2 6、U2 66、Raji、Jurkat、Daudi辐射敏感性的影响。结果表明 ,淋巴细胞恶性肿瘤株 82 2 6、U2 66、Raji、Jurkat、Daudi均存在 p53基因突变 ,高表达 Bcl- x

人bcl-xL基因在转基因小鼠中的整合和表达

目的研究人bcl-xL基因在显微注射所产生的子代小鼠中的整合、转录和表达情况。方法采用PCR和Southern blot方法检测人bcl-xL基因在小鼠体内的整合;RT-PCR方法检测它们的bcl-xL mRNA水平;用Western blot及免疫组化法检测目的蛋白的表达情况。结果在显微注射所产生的转基因小鼠中,有4只为Southern blot检测阳性,并且在这4只小鼠及其子代中均检测到人bcl-xL的mRNA和过表达的目的蛋白。结论由于在这些小鼠中既有外源基因的整合,又有其mRNA和蛋白质的表达,所以,它们是真正的转基因动物。

Bcl-xl和Bcl-2基因在人和兔心肌细胞中的同源性研究

目的 探讨兔和人的有核细胞中Bcl-xl和Bcl- 2基因的同源性。方法 用人的Bcl-xl和Bcl- 2基因序列来扩增兔心肌细胞的DNA ,纯化其扩增产物 ,然后进行测序 ,再测定人与兔心肌细胞内Bcl-xl和Bcl- 2基因的同源性。结果 兔心肌细胞内Bcl-xl基因的扩增产物长度为 16 2个碱基 ,与人类Bcl-xl基因的碱基序列进行比较 ,在扩增的 15 9个碱基片段中有 15 1个碱基相同 ,其同源性为 95 0 % ;而兔心肌细胞内Bcl- 2基因的扩增产物长度为 2 88个碱基 ,与人类Bcl- 2基因mR NA的碱基序列进行比较 ,在扩增的 199个碱基片段中有 176个碱基相同 ,其同源性为 88 4%。结论 兔和人的有核细胞中Bcl-xl和Bcl- 2基因有很好的同源性 ,在研究兔心肌细胞这两种基因的改变时 ,完全可以用人的Bcl-xl和Bcl- 2基因序列(引物 )来扩增 。

RNAi技术沉默Bcl-xL基因表达对食管癌细胞增殖和侵袭的影响

目的探讨RNA干扰(RNAi)技术沉默Bcl-xL基因表达对食管癌细胞增殖和侵袭能力的影响。方法将Bcl-xL小干扰RNA(siRNA)转染食管癌EC109细胞,分别采用荧光实时定量RT-PCR和Western blot方法检测食管癌细胞Bcl-xL mRNA和蛋白,采用软琼脂集落培养试验和Boyden小室模型检测癌细胞增殖和侵袭力。结果与对照组相比,siRNA转染组细胞Bcl-xL mRNA和蛋白水平明显下调(P均<0.05),所形成的软琼脂集落数和穿膜细胞数明显减少(P均<0.05),并均呈浓度依赖性。结论采用RNAi技术沉默Bcl-xL基因表达,可抑制食管癌细胞的增殖和侵袭能力。

喉鳞状细胞癌发生过程中Bak和Bcl-xl基因蛋白的参与 排除与性别和吸烟关系

目的:探讨促凋亡基因Bak和凋亡抑制基因Bcl-xl在喉鳞状细胞癌中的表达,及其与喉癌发生和预后的关系。方法:取哈尔滨医科大学附属二院耳鼻咽喉-头颈外科2000-07/2002-04行手术切除的45块喉原发性喉鳞癌及25块正常喉黏膜石蜡标本。检测标本组织中Bak和Bcl-xl蛋白的表达,采用免疫组织化学染色方法分析患者性别、吸烟情况、临床分期及不同肿瘤病理分级和淋巴结转移与喉癌组织中Bak和Bcl-xl蛋白表达的关系。结果:①正常喉黏膜Bak阳性表达:显著高于原发性喉鳞癌犤92%(23/25),44%(20/45),P<0.01犦。②正常喉黏膜Bcl-xl阳性表达:显著低于原发性喉鳞癌犤16%(4/25),53%(24/45),P<0.01犦。③喉癌组织中Bak和Bcl-xl蛋白的表达:与患者的性别、吸烟情况及临床分期无关(P>0.05),而与肿瘤病理分级和淋巴结转移显著相关(P<0.005,P<0.01)。结论:Bak在喉鳞癌中表达较正常喉黏膜明显减少,其表达下调与喉癌的发生密切相关。肿瘤分化越好,Bcl-xl的表达越强。Bak和Bcl-xl蛋白的表达与肿瘤病理分级和淋巴结转移显著相关,说明Bak蛋白表达对防止癌细胞转移、扩散具有积极意义,可作为对喉鳞癌预后判断的指标。

miRNA-326作用于其靶基因BCL-XL的研究

目的研究miRNA-326是否作用于其靶基因BCL-XL,探讨miRNA调控血小板凋亡的分子机制。方法利用萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶组成双荧光素酶报告基因实验系统,分别构建含有BCL-XL 3′端非翻译区(3′untranslated region,3′UTR)片段的野生型和变异型的双荧光素酶载体,设置对照组,转染细胞检测相对荧光强度。结果分别构建了PsiCHECK-BCL-XL-3′UTR-WT(野生型)和PsiCHECK-BCL-XL-3′UTR-MT(变异型)的双荧光素酶报告基因质粒载体;miRNA-326序列和PsiCHECK-BCL-XL-3′UTR-WT质粒共转染测定的相对荧光强度显著低于对照组(miRNA-326阴性对照序列和PsiCHECK-BCL-XL-3′UTR-WT质粒共转染组)(P=0.034);同时也显著低于miRNA-326序列和PsiCHECK-BCL-XL-3′UTR-MT质粒共转染的变异组(P=0.022)。结论miRNA-326作用于BCL-XL基因的3′UTR;这为研究miRNA调控血小板凋亡的分子机制奠定了基础。

携带Bcl-xl基因的重组慢病毒的制备和鉴定

目的制备携带Bcl-xl基因的重组慢病毒,并鉴定其感染细胞有效性。方法从本所以前构建的重组质粒pAAV-Bcl-xl获得Bcl-xl基因的编码序列,将其置换掉慢病毒质粒pSin-EF2-SOX2-Pur中的SOX2基因编码序列,从而得到重组慢病毒质粒pSin-EF2-Bcl-xl-Pur。然后利用这一质粒包装制备了携带Bcl-xl基因的重组慢病毒颗粒,用其感染细胞后用Western blot和流式检测仪分析了感染前后细胞中Bcl-xl基因的表达情况。结果感染后细胞中Bcl-xl蛋白的表达水平显著高于感染前。结论携带Bcl-xl基因的重组慢病毒颗粒包装成功,能高效感染细胞,为后续的遗传改造树突细胞打下了基础。

凋亡抑制基因在人卵巢癌细胞敏感株及耐药株中的表达

目的探讨凋亡抑制基因Bcl-2和Bcl-XL在人卵巢癌细胞敏感株(A2780)及耐药株(AD6)中的表达及其在卵巢癌多药耐药发生中的分子机制。方法采用DNA电泳、流式细胞技术及半定量逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术,检测不同浓度(3.0、6.0、9.9μg/ml)顺铂诱导的人卵巢癌细胞敏感株A2780及耐药株AD6的细胞凋亡及其Bcl-2和Bcl-XL基因的表达水平。结果①DNA凝胶电泳显示,不同浓度的顺铂均能诱导A2780和AD6细胞产生凋亡,呈现典型的凋亡梯度(DNA Ladder)。②流式细胞仪分析结果显示,不同顺铂浓度作用下A2780和AD6细胞凋亡率不同,AD6明显低于A2780(P<0.05)。③RT-PCR结果显示,A2780和AD6细胞均表达Bcl-2、Bcl-XL,但在AD6细胞株中2基因的表达明显强于A2780。在6.0μg/ml顺铂作用下A2780和AD6细胞株中2基因表达下调,但仍以在AD6的表达强于A2780。结论顺铂可诱导卵巢癌细胞凋亡,凋亡抑制基因Bcl-2和Bcl-XL在人卵巢癌多药耐药细胞株中高表达,是导致其细胞凋亡受抑制和对药物敏感性降低的重要原因。

脑缺血过程中B细胞淋巴瘤-2基因家族基因的表达及与细胞死亡的关系

为了了解Ｂ细胞淋巴瘤－２基因（ｂｃｌ－２）家族基因在脑缺血后表达规律及其调节细胞死亡的作用，通过阻塞大鼠双侧颈总动脉和椎动脉建立全脑缺血模型，观察了Ｂａｘ、ｂｃｌ－ｘＬ及ｂｃｌ－２基因表达变化以及与细胞死亡的关系。在缺血再灌流６ｈ，Ｂａｘ免疫染色增加，２４～４８ｈ达到高峰，ｂｃｌ－ｘＬｍＲＮＡ在２４ｈ后表达下降，ｂｃｌ－ｘＬ蛋白在４８ｈ可见明显降低，并且在缺血敏感神经元Ｂａｘ和ｂｃｌ－ｘＬ表达变化显著，与细胞凋亡发生的部位一致，相反，ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ和蛋白表达未见明显变化。提示ｂｃｌ－ｘＬ和Ｂａｘ可能参与脑缺血再灌流中神经细胞死亡的调节。

细菌内同源重组高效制备含绿色荧光蛋白和抗凋亡基因bcl-X_L的重组腺病毒载体

目的 :制备含绿色荧光蛋白和抗凋亡基因bcl-XL 的重组腺病毒载体。方法 :采用PCR方法从质粒pEGFP -C3 -bcl-XL 中扩增出bcl-XL 基因 ,再亚克隆至腺病毒穿梭质粒中 ,形成转移质粒pAdTrack -CMV -bcl-XL;然后与pAdEasy - 1共转化BJ51 83菌 ,采用细菌内同源重组法构建重组腺病毒质粒pAdEasy - 1 -gfp -bcl-XL,筛选同源重组的阳性克隆 ;抽提的pAdEasy - 1 -gfp -bcl-XL 经PacI线性化后 ,再用LIPOFECTAMINETM2 0 0 0介导转染至人胚肾 2 93细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒 ;采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定 ;用氯化铯超高速梯度离心纯化获取高滴度的重组腺病毒rAd -gfp -bcl-XL。结果 :由pAdTrack -CMV -bcl-XL 和pAdEasy - 1共转化BJ51 83菌1 6 - 2 0h后 ,可获得 35 %的阳性重组体细菌克隆。由重组质粒DNA经 2 93细胞包装后产生的重组腺病毒 ,经PCR检测表明含有目的基因bcl-XL。氯化铯纯化所得重组腺病毒滴度约为 6 5× 1 0 1 2 PFU/L。结论 :用细菌内同源重组法可以高效、简便、快捷地制备出重组腺病毒质粒载体 ,重组体病毒质粒经 2 93细胞包装、扩增和氯化铯纯化后可制备出高滴度的重组腺病毒颗粒rAd -gfp -bcl-XL,为人类相关疾病的基因治疗提供良好的基因转染载体。