强筋小麦龙麦26Glu-A3d基因遗传效应初步研究

龙麦26是东北春麦区强筋小麦育种的核心亲本,为进一步提高该品种品质潜力,拓宽其遗传基础,利用分子标记和6次选择性回交相结合的手段,将Glu-A3位点最优基因Glu-A3d导入龙麦26遗传背景之中,利用BC5F1、BC6F1群体和龙麦26的Glu-A3位点近等基因系为试材进行Glu-A3d基因遗传效应评价。结果表明,在强筋小麦品种龙麦26遗传背景下,导入Glu-A3d基因使籽粒蛋白、干面筋、面筋指数、吸水率、形成时间和稳定时间等指标3年平均分别提高0.07%、-2.13%、10.73%、0.13%、1.57%和4.97%。Zeleny沉降值和粉质仪的断裂时间2年平均分别提高3.05%和12.65%。以上结果表明,导入Glu-A3d基因使龙麦26品质性状均有不同程度提高。

D3基因在抗病防卫反应中的转录调控研究

水稻白叶枯病(bacterial leaf blight,BLB)是由水稻黄单胞菌属水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起的细菌性病害,严重影响水稻产量。随着基因技术的发展,编辑抗病基因是提高水稻抗病性降低该病害的发生的一种行之有效的方法。本研究首先对D3基因编辑株系和野生型进行白叶枯病菌接种实验来确定D3基因对于白叶枯病菌的抗性,其次利用高通量测序技术对已筛选出的遗传纯合D3基因编辑株系进行转录组分析,同时结合基因差异表达分析、基因家族分析和富集分析挖掘其在抗病相关通路上的潜在作用,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对部分差异表达基因(differential expressed genes,DEGs)进行验证。结果表明:接种白叶枯病菌后D3基因被显著诱导,同时D3基因编辑株系均表现出不同程度的白叶枯病抗性。转录组数据显示,与野生型相比,在转录组水平共鉴定到8184个差异表达基因,包含4201个上调基因和3983个下调基因,3组均呈现差异表达的相关基因共有359个。GO功能富集分析表明,D3基因编辑株系与野生型在生物学途径、细胞组分和分子功能上的相关基因均呈显著差异表达。KEGG代谢途径富集分析发现,DEGs显著富集于植物与病原菌互作、植物激素信号转导以及苯丙烷生物合成途径。本研究丰富了水稻D3基因在抗病相关基因转录调控方面的信息,为D3基因抗病功能研究拓展了思路。

LncRNA FOXD3-AS1靶向miR-127-3p对AngⅡ诱导的血管平滑肌细胞的影响

目的探讨长链非编码RNA(LncRNA)叉头盒转录基因D3反义RNA1(FOXD3-AS1)对血管紧张素(Ang)Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。方法采用0.001 mol/L的AngⅡ处理人主动脉VSMCs。实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测FOXD3-AS1和miR-127-3p的表达水平。CCK-8、流式细胞术、Transwell、Western印迹检测细胞活力、凋亡、迁移、侵袭及磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)和蛋白激酶B(AKT)的磷酸化水平。双荧光素酶报告基因实验和RT-qPCR验证FOXD3-AS1和miR-127-3p的靶向调控关系。结果AngⅡ诱导后VSMCs细胞存活率、迁移和侵袭细胞数、FOXD3-AS1、p-PI3K和p-AKT表达显著升高,凋亡率、miR-127-3p表达显著降低(P<0.05)。抑制FOXD3-AS1表达或过表达miR-127-3p后,AngⅡ处理的VSMCs细胞存活率、迁移和侵袭细胞数、p-PI3K和p-AKT表达显著降低,凋亡率显著升高(P<0.05)。FOXD3-AS1靶向负性调控miR-127-3p表达。抑制FOXD3-AS1能够逆转抑制miR-127-3p对AngⅡ处理的VSMCs细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及p-PI3K和p-AKT表达的影响(P<0.05)。结论抑制FOXD3-AS1能够降低AngⅡ诱导的VSMCs细胞增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡,其机制可能与上调miR-127-3p和抑制PI3K/AKT信号通路有关。

核糖体28S-D3等位基因特异扩增鉴别微小按蚊亲缘种A和C

目的 建立微小按蚊复合体不同亲缘种A和C的分子鉴别方法。方法 用单蚊蚊腿消化提取基因组DNA ,PCR特异扩增 2 8S第 3结构域 (D3 )基因 ,对PCR产物进行纯化、克隆、测序和序列分析 ;基于序列差异设计特异引物 ,进行等位基因特异扩增 (PCR -ASA) ,根据扩增片段大小区分微小按蚊不同亲缘种。结果 发现微小按蚊不同亲缘种A和C(GeneBank登录号 :AF416782 ,AF42 5 5 94) ,根据二者序列差异设计的特异引物能在普通琼脂糖凝胶上直观地区分两亲缘种 ,两者除在 3 76bp处有一共同条带外 ,分别在 2 94bp和 112bp处出现各自的特异扩增带。结论 我们建立的ASA分子鉴别方法能有效地将我国微小按蚊不同亲缘种A和C区分开来。

同源盒基因D3在胶质瘤中的表达及其生物学功能分析

目的探讨同源盒基因D3(HOXD3)在胶质瘤中的表达及其生物学功能。方法回顾性收集中国胶质瘤基因组图谱(CGGA)和癌症基因组图谱(TCGA)中1001例胶质瘤患者的临床资料及转录组数据,采用单因素方差分析比较不同病理分级胶质瘤间HOXD3表达水平的差异;并根据HOXD3表达水平的均值,分别将CGGA和TCGA数据库中的患者分为HOXD3低表达组与HOXD3高表达组,采用Kaplan-Meier生存分析比较HOXD3高表达组与HOXD3低表达组间生存期的差异,采用单因素回归分析及多因素Cox回归分析明确HOXD3对胶质瘤患者预后的影响;最后通过基因本体(GO)分析、京都基因和基因组百科全书(KEGG)分析以及基因富集分析(GSEA)探究HOXD3可能参与的信号通路,并采用Pearson相关分析法分析HOXD3与其他基因表达的相关性。结果(1)HOXD3的表达水平随着胶质瘤病理分级的升高逐渐升高(CGGA数据中Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤的表达水平分别为0.737±0.085、1.323±0.125、1.652±0.083;TCGA数据中Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤的表达水平分别为0.082±0.008、0.177±0.014、0.259±0.016),不同病理分级间HOXD3表达水平差异均有统计学意义(P<0.05)。(2)与HOXD3低表达组相比,HOXD3高表达组患者的生存期明显缩短,差异有统计学意义(P<0.05)。CGGA数据显示HOXD3表达水平(HR=1.348,95%CI:1.171~1.552,P=0.000)、肿瘤病理分级和异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)突变状态为胶质瘤患者预后的独立影响因素;TCGA数据显示HOXD3表达水平(HR=2.147,95%CI:1.252~3.681,P=0.005)、年龄、肿瘤病理分级和IDH1突变状态为胶质瘤患者预后的独立影响因素。(3)GO分析、KEGG分析和GSEA结果均提示HOXD3参与细胞周期的调控;Pearson相关分析发现HOXD3的表达水平与多种细胞周期调控基因的表达水平呈明显正相关关系(P<0.05)。结论HOXD3为胶质瘤预后的独立影响因素,其生物学功能与胶质瘤细胞的周期调控相关。

猪嵴病毒福建株3D基因的克隆及遗传进化分析

根据GenBank中登录的猪嵴病毒(porcine kobuvirus,PKV)3D基因序列特征设计特异性引物,采用RT-PCR方法从福建省某猪场采集腹泻粪便样品和小肠组织混合物中扩增猪嵴病毒3D基因,将扩增后的目的片段克隆后进行序列测定。结果表明,所扩增的目的片段编码有完整的3D开放阅读框,全长为1 407bp,编码有468个氨基酸。运用生物信息学软件,将获得3D基因序列和GenBank的猪嵴病毒株3D基因序列进行分析比较,该毒株的3D基因序列和SH-W-CHN/2010/China毒株的核苷酸同源性最高,为93.6%,与WH1株核苷酸同源性最低,为92%。从遗传进化上看,猪嵴病毒和其他中国株在遗传进化上处在一个同一分支,匈牙利分离株处在另一分支,表明猪嵴病毒可能在欧亚大陆上各自独立进化。

多巴胺D_3受体基因Ser9Gly多态性与阿立哌唑及利培酮治疗效应的关联研究

目的比较阿立哌唑与利培酮治疗女性首发精神分裂症患者的疗效和血浆催乳素水平变化及其与多巴胺D3受体(DRD3)基因Ser9Gly(rs6280)多态性的关联。方法选择完成8周阿立哌唑或利培酮治疗的女性首发精神分裂症患者各60例,于治疗前和治疗8周后分别评测阳性与阴性症状量表(positive and negativesymptom scale,PANSS)。采用放射免疫法检测血浆催乳素水平,DNA测序技术检测DRD3基因Ser9Gly多态性,分析DRD3基因Ser9Gly多态性与两药疗效及血浆催乳素变化的关联。结果治疗8周后,两组PANSS减分率的差异无统计学意义[(59.79±23.48)vs.(63.30±22.66),P>0.05],但利培酮组血浆催乳素的变化值高于阿立哌唑组[(26.92±9.48)vs.(-25.25±8.07),P<0.05]。利培酮组中C等位基因携带者的血浆催乳素的增加明显高于未携带者[(52.48±27.01)ng/mL vs(36.07±17.46),P<0.05];而阿立哌唑组中未见此差异[(-23.27±8.36)vs.TT(-26.05±8.11),P>0.05]。两组8周后PANSS减分率(%)与DRD3基因Ser9Gly的差异均无统计学意义:阿立哌唑组[CC+CT(57.83±19.94)vs.TT(56.84±18.46),P>0.05];利培酮组[CC+CT(53.94±21.08)vs.TT(60.38±19.37),P>0.05]。结论阿立哌唑治疗女性首发精神分裂症疗效与利培酮相当,但引起血浆催乳素水平变化的幅度较小;利培酮引起血浆催乳素水平增加可能与DRD3基因Ser9Gly多态性有关联。

口蹄疫病毒3D基因在重组杆状病毒中的表达及检测

利用杆状病毒表达系统进行了口蹄疫病毒3D基因在Sf9细胞中的表达研究。首先克隆了3D基因片段,将pMD18_3D质粒及杆状病毒转座载体质粒pFastBacⅠ分别用EcoRⅠ及XbaⅠ酶切后,用T4DNA连接酶连接,构建了重组质粒pFastBac_3D;再将该重组质粒转化DH10Bac感受态细菌,在体内进行重组,并经三重抗性与蓝白斑筛选,得到杆状病毒重组质粒Bacmid_3D;将Bacmid_3D转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒,并进行表达水平的检测。经SDS_PAGE和West ernblot检测,结果表明,3D蛋白在重组杆状病毒中获得表达。

2012年猪嵴病毒流行病学调查及3D基因的遗传变异分析

为了解猪嵴病毒(PKV)的流行及变异情况,本研究根据PKV的3D基因保守区域核苷酸序列设计一对特异性引物,并利用RT-PCR方法对2012年来自24个省市84个猪场的病料样品共计236份进行3D基因的检测。结果显示:在236份病料中,共有63份为PKV阳性,阳性率为36.69%;而在检测的84个猪场中,共有36个猪场显示PKV阳性,猪场阳性率为42.85%。此外,对2012年分离的9个PKV部分3D基因进行测序分析,并与GenBank中登录的人、牛、猪以及鼠等嵴病毒株相关序列进行遗传变异分析。结果表明9个PKV 3D基因与国内外其他PKV株无论是在核苷酸水平上还是在氨基端水平上均具有较高的同源性,表明PKV的3D基因具有较高的保守性,可以作为病原检测的靶基因。

I型鸭肝炎病毒VP1、3D基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中的I型鸭肝炎病毒全基因序列设计了扩增I型鸭肝炎病毒VP1、3D基因的引物,用该特异性表达引物从I型鸭肝炎病毒cDNA模板中扩增得到目的基因VP1、3D,用相同的限制性内切酶酶切目的基因和表达载体pET32a后构建重组表达载体,转化宿主BL21(DE3),用不同浓度的IPTG诱导VP1、3D基因的表达,收集菌液进行SDS-PAGE电泳,Western-blotting分析蛋白免疫原性。结果表明,VP1、3D在大肠杆菌中表达量较高,表达产物的分子量约为48kD、68kD,并能被兔抗DHV-1血清所识别。I型鸭肝炎病毒VP1、3D蛋白在大肠杆菌中表达产物具有免疫原性。

多巴胺D3受体基因Ser9Gly多态性与抑郁症的相关研究

目的 探讨多巴胺D3受体基因（D3R基因）Ser9Gly多态性在抑郁症发病机制中的作用.方法 选取50例抑郁症患者作为抑郁症组,另外选取30例健康体检者作为对照组.采集全血标本,提取模板DNA,特定引物扩增D3R基因片断,用限制性内切酶Mls Ⅰ（Bal Ⅰ）进行酶切,鉴定基因型.所有结果数据均采用SigmaStat统计分析软件包进行统计分析.结果 抑郁症组与对照组之间D3R基因Ser9Gly多态性位点等位基因频率、基因型分布之间差异无统计学意义（P〉0.05）.抑郁症患者D3R基因Ser9Gly多态性基因型分布频率为：Ser/Ser 40%,Ser/Gly 46%,Gly/Gly 14%.D3R基因Ser9Gly多态性位点基因型分布的两两比较显示：Ser/Ser与Ser/Gly、Ser/Ser与Gly/Gly、Ser/Gly与Gly/Gly之间的差异均无统计学意义（P〉0.05）.结论 抑郁症患者的D3R基因Ser9Gly多态性与抑郁症的发病无相关性.

口蹄疫病毒3D基因的克隆及其编码蛋白的结构和功能预测

采用RT-PCR技术,对AsiaⅠ型口蹄疫病毒的3D基因进行克隆,并对其序列进行比对,同时利用Ex-pasy等生物软件对3D蛋白的二级、三级结构及生物学特性进行预测和分析.结果表明:3D蛋白在口蹄疫各血清型间高度保守,分子中含有一个糖基化位点及多个酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸位点,并存在一个单股正链RNA病毒依赖RNA多聚酶的催化区;结构特点显示3D蛋白为口蹄疫病毒复制所需的多聚酶.

绵羊Dlx3基因启动子活性及其多态性与羊毛品质性状的关联

【目的】通过开展绵羊Dlx3基因启动子结构、活性、多态性及其与羊毛品质性状的关联等分析,揭示Dlx3基因在绵羊毛囊发育中的作用及其作用机制。【方法】采用PCR扩增Dlx3基因起始密码子上游1.5 kb区域,利用荧光素酶报告基因技术分析Dlx3基因启动子活性,采用测序方法寻找Dlx3基因启动子区SNP,并利用PCR-RFLP技术进行SNP分型。【结果】①Dlx3基因启动子近端序列的保守性较高,该区域内人、鼠及绵羊都具有23个保守的转录因子结合位点和一个CpG岛,而启动子的远端序列的保守性较低;②Dlx3基因的启动子在绵羊胚胎成纤维细胞中具有启动子活性;③Dlx3基因启动子的-1 551—-1 108 bp与-1 108—-707 bp区域对启动子活性影响较大;④Dlx3基因启动子区SNP位点(G-1166A)多态性与羊毛卷曲度显著相关。【结论】①Dlx3基因启动子在绵羊胚胎成纤维细胞中有活性;②Dlx3基因启动子的近端序列组成在人、鼠和绵羊中较为保守,而其远端序列的保守性较低,但是Dlx3基因启动子的远端序列对启动子活性影响较大;③Dlx3基因启动子区G-1166A位点是羊毛卷曲度的一个分子标记。

羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因在杆状病毒中的串联表达

本研究通过构建含有3拷贝羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因的重组杆状病毒,旨在通过昆虫细胞表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白,为原核表达和真核表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白的免疫效果的比较奠定了基础。将细粒棘球蚴EG95s基因与3拷贝羊C3d基因串联,插入pTarget载体,获得重组质粒pTarget-EG95-(C3d)3,利用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切位点将目的基因EG95-(C3d)3克隆至Bac-to-Bac系统的转移载体pFastBac-Hta中,获得pFastBacHta-EG95-(C3d)3重组质粒,将该重组质粒转化含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中进行转座重组,获得携带3拷贝羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因的重组转座子rBacmid-EG95-(C3d)3,转染Sf9昆虫细胞后获得EG95-(C3d)3重组杆状病毒,并表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting进行重组蛋白的鉴定。同时利用昆虫细胞表达蛋白对羊棘球蚴病特异性抗体进行检测。结果表明,获得了EG95-(C3d)3重组杆状病毒,且EG95-(C3d)3重组融合蛋白在Sf9昆虫细胞得到了正确表达,大小约为132ku,Western blotting鉴定结果显示表达的EG95-(C3d)3重组融合蛋白能与细粒棘球蚴阳性血清产生特异性反应,表明EG95-(C3d)3基因表达产物具有免疫活性。同时表达蛋白对羊棘球蚴病特异性抗体有良好的敏感性。EG95-(C3d)3基因在昆虫细胞获得表达,为原核表达和真核表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白的免疫效果的比较,及细粒棘球蚴病的高效检测方法的建立奠定了基础。

鸭甲型肝炎病毒-Ⅰ型3D基因在昆虫细胞中的表达及抗原检测

通过高保真PCR方法扩增出鸭甲型肝炎病毒-Ⅰ型(DHAV-Ⅰ)RNA依赖的RNA聚合酶3 D基因,克隆至杆状病毒表达载体pFastBac1中,构建重组杆状病毒转移载体pFB-3D,将其转化感受态细胞DH10Bac,获得重组杆粒rBacmid-3D,转染昆虫细胞Sf9,收获重组杆状病毒rBac-3D,通过间接免疫荧光、Western blot对重组蛋白的表达水平进行检测。结果表明:间接免疫荧光数据显示表达的重组蛋白能与鸭抗全病毒阳性血清发生特异性结合,Western blot表达的重组蛋白分子量约为51ku,与理论值相符。这一研究说明3D蛋白在昆虫细胞中获得成功表达,为DHAV-Ⅰ型ELISA检测试剂盒的研制提供了技术基础。

1型鸭甲型肝炎病毒3D基因的原核表达与多抗制备

根据血清1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1)SH株3D基因序列设计并合成1对特异性引物,通过RT-PCR方法扩增3D基因,将其克隆入原核表达载体p ET-32a,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导培养下重组蛋白获得了成功表达。SDS-PAGE显示重组蛋白的分子量约为68 k D,Western blot分析显示该重组蛋白能与多聚组氨酸标签单抗发生特异性反应。将切胶后纯化的目的蛋白免疫ICR小鼠,制备针对重组蛋白的多抗血清,Western blot结果显示制备的抗血清能够与DHAV-1感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。以上结果表明,3D基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的多抗血清可以用于3D蛋白的检测,为3D蛋白的功能研究奠定了基础。

口蹄疫病毒AF72株3D聚合酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

采用RT-PCR方法扩增口蹄疫病毒(FMDV)AF72株的3D聚合酶基因,并将其克隆至pGEM-T easy载体,测序分析结果表明,AF72 3D聚合酶基因与GenBank中公布的其他4个参考序列均具有较高的同源性。将目的基因插入原核表达载体pET-30a(+)中,构建了重组表达质粒pET-3D,鉴定后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,3D聚合酶基因在大肠杆菌中获得了正确表达,目的蛋白的分子量为46 ku。Western blot检测结果显示,表达产物可以与抗A型FMDV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。

口蹄疫病毒P12X3C3D多基因编码蛋白在昆虫细胞中的表达与检测

利用杆状病毒表达系统构建了包含有口蹄疫病毒(FMDV)P12X3C3D多基因片段的重组杆状病毒。将该病毒感染Sf9细胞后,利用SDS-PAGE及夹心ELISA方法检测目的蛋白的表达。结果表明,重组杆状病毒能够表达FMDV目的蛋白,该表达产物能被FMDV阳性血清识别,具有一定的反应原性。

口蹄疫病毒RNA聚合酶3D基因在毕赤酵母中的表达

以口蹄疫病毒 (Foot and mouthdiseasevirus ,FMDV)RNA聚合酶基因 3D为研究对象 ,对其部分碱基进行定点诱变 ,替换成在毕赤酵母 (Pichiapastoris)中使用频率较高的密码子以优化其表达。改造后的目的片段用NotⅠ和AvrⅡ内切酶双酶切 ,然后与相应内切酶双酶切的穿梭载体pPIC9K相连接 ,构建重组表达载体 pPIC9K/ 3D ,转化大肠埃希氏菌JM 10 9,筛选阳性克隆pPIC9K/ 3D。经测序表明 ,插入位置、突变碱基、片段大小和读码框均正确。重组质粒用SacⅠ内切酶线化 ,电转化毕赤酵母SMD116 8,采用G4 18抗性梯度法筛选 ,获得高拷贝整合重组菌株SMD116 8/ pPIC9K/ 3DHIS+MUT+,利用甲醇进行诱导分泌表达 ,经SDS PAGE和Westernblot ting鉴定 ,3D基因在毕赤酵母中表达成功 ,目的蛋白分子质量大小为 5 2ku ,与预期的大小吻合 ,并能够被FMDV阳性血清所识别 ,表达量占总分泌蛋白量的 36 %。

逆转录病毒载体介导的稳定表达口蹄疫病毒3D基因的BHK21细胞系的建立

【目的】研究口蹄疫病毒RNA聚合酶在BHK-21细胞中的稳定表达状况,为研究RNA聚合酶生物学活性及其基因工程疫苗研制提供科学依据。【方法】从重组质粒pMD18-T-3D扩增口蹄疫病毒3D基因,通过分子克隆技术构建重组逆转录病毒表达载体pBPSTR1-3D。用pBPSTR1-3D和pVSV-G双质粒瞬时转染GP2-293包装细胞,收获重组逆转录病毒,然后感染BHK-21细胞,嘌呤霉素持续筛选12d后获得阳性克隆,并用有限稀释法挑选单个阳性细胞克隆。【结果】应用PCR、RT-PCR技术可从体外反复传代的阳性细胞中扩增到3D基因,证实目的外源基因能转录并被稳定整合进宿主细胞基因组中。经SDS-PAGE、Westernblot、间接免疫荧光检测到在不同代次的阳性细胞中有目的蛋白表达。【结论】本试验利用逆转录病毒载体介导的基因转移技术,将外源基因插入到靶细胞的基因组中,构建了稳定表达口蹄疫病毒RNA聚合酶的包装细胞系,为研究3D基因表达及其蛋白定位提供了方便,也为下一步研究RNA聚合酶生物学功能和疫苗研制提供了科学依据。