靶向性发夹状RNA对卵巢癌SKOV3细胞H-ras基因表达的影响

目的 运用构建的小发夹状RNA重组质粒pshRNA／H—ras，研究其对卵巢癌SK—OV3细胞株内源H-ras基因的抑制作用。方法 应用基因克隆技术，设计含21bp H—ras基因编码序列片段及中间以4～5个bp间隔的反向重复序列，克隆至转录载体pTZU6＋1上并行序列分析。转染重组质粒pshRNA／H—ras至SKOV3细胞中，分别采用RT-PCR、Western blot检测细胞内H-rasmRNA和蛋白表达的变化。结果 成功构建发夹状RNA载体，经DNA序列鉴定为正确的目的序列。RT-PCR和Western blot结果表明，重组质粒pshRNA／H—ras1和pshRNA／H—ras2均能在基因转录水平和蛋白表达水平上明显抑制SKOV3细胞内源H—ras蛋白的表达，抑制率达67％以上。结论 重组质粒pshRNA／H—ras可显著抑制SKOV3细胞内源H-ras基因mRNA的转录和相应蛋白质的表达，为进一步研究H-ras基因在卵巢癌细胞异常增殖中的作用打下基础。

电化学发光PCR定量检测H-ras癌基因点突变

提出了一种电化学发光PCR(ECL-PCR)分析方法, 该法可用于定量检测基因点突变. 其检测H-ras癌基因PCR扩增产物的灵敏度可达100 fmol;线性范围为0.1～500 pmol. 用ECL-PCR分析法对膀胱癌组织中H-ras癌基因进行突变检测, 只需要10 μL样品, 20 min的孵育时间和30 s的采集时间, 得出20例膀胱癌样品中有7例存在点突变, 通过标准曲线方程定量计算出突变样品的量. ECL-PCR分析方法在灵敏度、线性范围、分析时间等方面都优于传统的检测方法, 是一种安全、快速、灵敏、定量检测基因点突变的分析方法.

肾脏移植后慢性移植物肾病相关基因C-H-ras、TGF-β_1、HSP70和HSP90的表达

目的探讨肾脏移植后慢性移植物肾病（CAN）相关基因C-H-ras、TGF-β1、HSP70及HSP90的表达及其意义。方法实验分为3组：正常对照组10例，为正常肾脏标本；术中穿刺组10例，为肾脏移植术中复流40～60min后的移植肾穿刺标本；CAN组8例，为木后1～7年CAN患者肾组织穿刺标本。采用免疫组织化学及原位杂交法对每例标本行C—H—ras、TGF-β1、HSP70及HSP90蛋白和mRNA表达水平检测。结果术中穿刺组HSP70表达水平最高，CAN组C—H—ras、TGF-β1及HSP90表达水平最高。结论c—H—ras和TGF-β1两种基因的共同高表达与CAN的发生发展关系密切。调控相关基因的表达可能有助于延缓和治疗CAN。

SBHL对HeLa细胞c-myc,H-ras和hTRT基因表达的研究

目的观察澳洲茄胺盐酸盐对HeLa细胞c-myc，H—ras和hTRT基因表达的影响．方法用鼠抗人c-mycMcAb，H-ras McAb和hTRTPcAb作为一抗，生物素化羊抗鼠IgG作为二抗，用免疫组化方法测定澳洲茄胺盐酸盐对HeLa细胞c-myc，H—ms和hTRT基因的表达．结果澳洲茄胺盐酸盐处理的HeLa细胞与对照组相比，c-myc，H-ras和hTRT基因的表达均明显降低（P〈0．05）．结论澳洲茄胺盐酸盐下调HeLa细胞c-myc和H-ras基因的表达，抑制细胞增殖，诱导分化；澳洲茄胺盐酸盐下调HeLa细胞hTRT基因的表达，抑制端粒酶活性，抑制细胞生长．

胃癌组织中法尼基转移酶基因表达与临床病理特点及H-ras突变的关系

目的:检测人胃癌及相应癌旁组织中法尼基转移酶(FTase)β-亚单位mRNA表达和H-ras基因第12密码子点突变探讨FTaseβ-亚单位基因在胃癌中的表达与临床病理特点、H-ras基因突变的关系.方法:收集胃癌及相应癌旁正常组织标本43例.应用半定量逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)测定FTaseβ-亚单位mRNA基因表达水平,应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析H-ras基因第12密码子点突变情况.采用秩和检验分析胃癌和癌旁组织的FTaseβ亚单位mRNA表达的配对数据的差异;采用多元逐步回归分析胃癌组织中FTaseβ亚单位mRNA表达活性与临床病理特点及H-ras基因突变间的关系.结果:胃癌组织中FTaseβ亚单位mRNA的平均值明显高于癌旁组织(0.89±0.48vs0.69±0.40),两者相比有显著性差异(Z=2.469,P=0.014).在43例胃癌组织中有1例发现突变(1/43,2.3%),癌旁组织中未发现突变.胃癌组织的FTaseβ亚单位mRNA表达活性与年龄、肿瘤部位、组织学分级、有无淋巴结转移及有无H-ras基因突变无关,在女性,病理分型为印戒细胞癌的胃癌组织中有较高的FTaseβ亚单位mRNA表达活性.结论:FTaseβ亚单位mRNA在胃癌组织中表达升高.胃癌组织中H-ras基因第12密码子点突变率低,在胃癌的发生中不起主要作用,并且与FTaseβ亚单位mRNA的表达无相关.

H-ras干扰性RNA对卵巢癌裸鼠皮下移植瘤CD44V6表达的影响

目的应用重组质粒pshRNA/H-ras转染卵巢癌SKOV3荷瘤裸鼠,观察Ras信号传导通路中信号分子的变化。方法选用裸鼠20只建立卵巢癌裸鼠皮下成瘤模型,分别设立对照组和实验组,应用陡脉冲电转重组质粒pshRNA/H-ras于瘤体中,于治疗后21天处死裸鼠并取瘤体组织固定,免疫组织化学SP法检测CD44V6的表达。结果对照组细胞膜、浆中见变异型细胞黏附分子44(CD44V6)的阳性表达,而转染pshRNA/H-ras实验组CD44V6的表达显著下降,差异有统计学意义(P＜0．05)。结论H-ras的小干扰性RNA可下调与肿瘤转移相关基因的表达,对阻止肿瘤侵袭转移具有较好的研究价值。

高灵敏度电化学发光PCR方法检测基因点突变研究(英文)

近年来发展了一种用于定量检测基因点突变的电化学发光PCR方法。该法采用三联吡啶钌标记的上游引物和生物素标记的下游引物对待测基因进行PCR扩增;随后,采用特定的限制性内切酶对扩增产物进行酶切,由于野生型样品和突变型样品间存在酶切位点的变化,其中只有一种基因型样品能被切断;通过生物素与链霉亲和素包被的磁珠连接,将生物素标记的DNA片段收集到样品池中;进行电化学发光检测,通过所得信号的有无可以判断其基因型。我们分别将该法用于Presenilin-1基因和H-ras癌基因的点突变检测,结果均可明显区分突变型样品和野生型样品。该法具有灵敏、快速、简便、安全等优点,是一种实用的基因点突变检测方法。