Sonic Hedgehog信号通路与乳腺癌抑癌基因LKB1的相互影响

目的:研究环靶明(cyclopamine)抑制Sonic Hedgehog(SHH)信号通路后,转染LKB1基因的乳癌细胞的凋亡、周期及信号通路相关基因表达的改变。方法:抑癌基因LKB1转染人乳腺癌细胞MDA-MB-231,分MDA-MB-231组(231组)和转染LKB1基因的MDA-MB-231(LKB1组)两组,每组分别采用0,5×10-6mol/L,10×10-6mol/L,20×10-6mol/L 4种浓度的环靶明处理细胞,各小组细胞分别采用流式细胞仪检测细胞凋亡和周期,用RT-PCR法和Western blot法检测Sonic Hedgehog信号通路相关基因Shh、Smo、Ptch、Sufu、Hip及LKB1的mRNA和蛋白表达水平。结果 :在LKB1组和231组中,各小组细胞的凋亡率变化与Sonic Hedgehog相关基因Shh、Smo表达变化一致,随环靶明浓度增大凋亡率增加、基因表达受抑制,在环靶明浓度达10×10-6mol/L时变化最明显,且LKB1组较231组的变化更为明显。在231组中,各小组细胞周期变化与Sonic Hedgehog相关抑制基因Sufu、Hip表达变化一致。而在LKB1组中,各小组细胞周期与抑制基因Sufu、Hip表达变化均无明显差异。在231组中,各小组抑癌基因LKB1的表达随药物浓度增加渐增强。Ptch表达在两组均无明显变化。结论 :抑癌基因LKB1可协同Sonic Hedgehog信号通路抑制剂环靶明促进乳腺癌细胞凋亡,调控细胞周期,推测其机制可能是通过如上信号通路相关基因表达变化而实现。信号通路抑制剂环靶明可提高乳腺癌细胞抑癌基因LKB1的表达,推测此也是信号通路抑制剂降低癌细胞活性机制之一。

抑癌基因LKB1在胃癌组织表达及意义

目的探讨抑癌基因LKB1在胃癌组织表达及意义。方法应用免疫组织化学方法检测60例胃腺癌组织(胃癌组)、16例正常胃黏膜组织(正常组)和21例癌旁胃黏膜组织(癌旁组)标本LKB1的表达,并分析其与肿瘤临床病理特征的关系。结果 LKB1正常组100.0%强阳性表达,癌旁组61.9%强阳性、38.1%弱阳性表达,胃癌组46.7%弱阳性表达,各组间比较差异有显著性(H=60.412,P<0.001)。胃癌组LKB1阳性表达与pT分期及分化程度有关(χ2=9.386、4.275,P<0.05),与病人年龄、性别、大体分型、解剖位置及淋巴结有无转移无关(P>0.05)。结论 LKB1基因表达与胃癌存在密切关联,检测其在胃癌组织或胃癌细胞中的表达,可为胃癌的诊断提供参考依据。

PJ综合症相关抑癌基因LKB1/STK11的逆转录PCR法克隆及序列分析

从正常人胎盘组织中克隆出人野生型PJ综合症相关抑癌基因LKB1/STK11cDNA片段.以提取的总RNA为模板,采用逆转录法获得cDNA第一条链,采用94℃变性、72℃退火及延伸的特殊条件,经PCR扩增出抑癌基因LKB1/STK11cDNA片段,克隆到T载体,在国内首次报道了LKB1/STK11基因的克隆.序列分析表明,该cDNA全长1299bp,与GenBank中人野生型LKB1cDNA编码序列完全相同,证实获得了人野生型抑癌基因LKB1/STK11的cDNA克隆.LKB1/STK11cDNA的成功克隆为其原核表达载体的构建和LKB1/STK11蛋白在细胞内的作用及其抑癌效果、抑癌机理的研究打下了基础.

乳腺癌中Hedgehog信号通路的表达及其与LKB1基因相关性的研究

目的:探讨Hedgehog(Hh)信号通路主要蛋白在乳腺癌中的表达及其与LKB1基因的相关性,以及与临床病理特征、预后的关系。方法:采用免疫组化方法检测75例人乳腺癌标本中Hh信号通路主要蛋白(Shh、Smo、Sufu、Gli1、Ptch)及LKB1基因的表达,分析二者相关性,并分析Hh信号通路的表达与临床病理特征及预后的关系。结果:在75例乳腺癌样本中,阳性表达Shh、Gli1、Smo、Ptch、Sufu、LKB1分别为69(92.0%)、58(77.3%)、65(86.7%)、50(66.7%)、34(45.3%)、33(44.0%),而在其相邻的正常乳腺上皮不表达或低表达。Hh信号通路与LKB1的表达呈负相关;Hh信号通路的表达情况与患者年龄、淋巴结转移情况、分子分型具有一定的相关性,且高表达的患者预后较差。结论:Hh信号通路在乳腺癌中过度激活,与临床病理特征及预后相关,并与LKB1基因的表达呈负相关,两者之间的相互作用对乳腺癌的诊治及预后可能有重要影响。

LKB1基因沉默对乳腺癌细胞生物学行为的影响

目的研究LKB1基因表达沉默对乳腺癌细胞生物学行为的影响。方法以RNA干扰技术建立LKB1表达抑制的细胞模型,RT-PCR和Western印迹法检测干扰LKB1蛋白表达的效果;通过绘制细胞生长曲线检测LKB1基因沉默乳腺癌细胞的增殖变化;流式细胞技术分析LKB1基因沉默后乳腺癌细胞周期的变化及其凋亡和增殖情况。结果成功建立了LKB1基因沉默乳腺癌细胞模型,稳定表达LKB1-siRNA细胞的LKB1蛋白表达明显被抑制,LKB1基因沉默后乳腺癌细胞增殖明显加快。结论 LKB1基因的下调表达对乳腺癌细胞部分恶性生物学行为的发生有一定的促进作用。

LKB1基因在不同基因亚型乳腺癌中表达的意义

目的:检测LKB1基因在不同基因亚型乳腺癌中的表达,并探讨其在乳腺癌中表达的意义。方法:应用组织芯片及免疫组织化学法对180例乳腺浸润性导管癌、18例导管原位癌及20例正常乳腺组织中LKB1基因、ER、PR、HER-2、CK56、和P53的表达进行检测;根据最近提出的乳腺癌分子分型进行分组,对LKB1基因在不同基因亚型中的表达及与其他临床病理特征的关系进行统计学分析。结果:LKB1基因在乳腺导管原位癌的阳性率为66.11%(11/18),浸润性导管癌的阳性率为36.67%(66/180),两组间差异有统计学意义(P<0.05);在浸润性导管癌中,LKB1基因在淋巴结转移组阳性率为47.61%(40/84),无转移组阳性率为83.33%(80/96),两组间差异具有统计学意义(P<0.01);在不同基因亚型中中LKB1基因的表达差异具有统计学意义(P<0.05);其中Luminal A组与HER-2+组及三阴性组两两比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:LKB1基因的在乳腺浸润性导管癌中的表达明显低于导管原位癌,与淋巴结转移呈负相关,且在生物学行为更为恶性的HER-2+组和三阴性组具有更低的表达水平,提示LKB1基因对乳腺癌的浸润与转移过程有抑制作用。

人乳腺癌裸鼠移植瘤组织中LKB1基因过表达抑制HER-2蛋白表达

目的:探讨不同LKB1基因表达的人乳腺癌裸鼠移植瘤组织中HER-2蛋白的表达。方法:建立不同LKB1基因表达的人乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型,免疫组化检测原位移植瘤组织中LKB1及ER,PR,HER-2表达。结果:LKB1低表达的MDA-MB-435细胞株(MDA-MB-435)裸鼠移植瘤及转染空质粒的MDA-MB-435(MDA-MB-435/vect)裸鼠移植瘤组织中HER-2蛋白呈高表达,而转染LKB1cDNA的MDA-MB-435(MDA-MB-435/LKB1)裸鼠移植瘤组织中HER-2蛋白呈低表达,转染与未转染LKB1的裸鼠移植瘤组织中HER-2蛋白表达差异显著,具有统计学显著意义(P<0.01)。三组中ER,PR的表达无显著差异。结论:人乳腺癌裸鼠移植瘤中LKB1基因的过表达抑制HER-2蛋白表达。

转染LKB1基因乳腺癌细胞与胚胎发育信号通路及cAMP/PKA通路的关系

目的探讨抑癌基因LKB1与胚胎发育(Sonic Hedgehog,SHH)信号通路、cAMP/PKA信号通路之间的相互关系。方法抑癌基因LKB1转染人乳腺癌细胞MDA-MB-231,分MDA-MB-231组(231组)和转染LKB1基因的MDA-MB-231(LKB1组)两组,每组分别采用0、5×10-6、1×10-5、2×10-5 mol/L等4种浓度的SHH信号通路抑制剂环靶明(cyclopamine)作用于细胞,各小组细胞分别用RT-PCR法和Western blot法检测SHH信号通路相关基因SHH、Smo的mRNA表达水平和蛋白表达水平,用cAMP、PKA试剂盒检测cAMP、PKA数值水平。结果 LKB1组的细胞通过不同剂量环靶明抑制后,SHH信号通路相关基因SHH、Smo的mRNA和蛋白表达水平相应较231组明显抑制,且与环靶明剂量呈正相关,抑制效果在环靶明浓度为10×10-6 mol/L时最明显,继续增加环靶明浓度到20×10-6 mol/L,抑制效果保持不变。231组和LKB1组中细胞的PKA和cAMP数值均随环靶明浓度增加而增高,至10×10-6 mol/L时达到最高,继续增加环靶明浓度到20×10-6 mol/L,两组中的PKA和cAMP数值保持不变。在相同环靶明浓度下,LKB1组中PKA和cAMP数值高于231组中相应数值。结论抑癌基因LKB1协同环靶明抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的SHH信号通路的同时亦协同增加cAMP/PKA信号通路的表达,且在环靶明浓度为10×10-6 mol/L时效果最明显;推测存在LKB1-SHH-cAMP/PKA通路。

散发性Peutz-Jeghers综合征患者LKB1基因突变情况

目的研究LKB1基因突变和甲基化在散发性Peutz-Jeghers综合征(P-J综合征)患者中的作用。方法提取5例散发性Peutz-Jeghers综合征患者外周血和其中3例的大肠息肉组织DNA,采用PCR法分析其序列的突变情况,MSP法检测基因启动子区域甲基化情况。结果在所有患者外周血和大肠息肉组织DNA中均未发现有病理意义的突变位点,在1例发生癌变的息肉组织DNA中检测到LKB1基因的甲基化。结论并非所有P-J综合征的患者都出现LKB1基因的序列突变,P-J综合征的发病可能存在其他的分子机制,但甲基化状态的改变可能是其息肉发生癌变的机制。

RNA干扰LKB1基因对前列腺癌细胞增殖的影响

目的:探讨LKB1/STKll(Liver kinase B1/Serine-Threonine Kinase II)基因沉默对前列腺癌细胞株PC-3中增殖相关因子细胞周期素D1(cyclin D1)、微小染色体维持缺陷蛋白2(Mcm2)和增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响及其可能机制。方法:将重组表达质粒LKB1-shRNA1(LKB1-shRNA1组)和阴性对照质粒sh NC(阴性对照组)采用脂质体介导法转染至前列腺癌细胞株PC-3中,并设未转染组,经G418筛选出稳定转染细胞,RT-PCR法检测转染前后细胞中LKB1,cyclin D1,Mcm2和PCNA基因mRNA的转录水平;Western blot法检测转染前后细胞中LKB1,cyclin D1,Mcm2和PCNA蛋白表达水平;CCK-8法检测转染后细胞的增殖能力。结果:与未转染组和阴性对照组相比,LKB1-shRNA1组细胞中LKB1,cyclin D1,Mcm2和PCNA的mRNA和蛋白表达水平均明显上调,LKB1-shRNA1组PC-3细胞的生长速度明显增加。结论:LKB1基因沉默上调前列腺癌细胞中cyclin D1,Mcm2和PCNA的表达,LKB1可作为研究前列腺癌细胞增殖分子机制的新靶点。

LKB1基因对乳腺癌细胞促进微血管生成的因子基因表达的影响

目的 研究LKB1基因对乳腺癌细胞促进微血管生成的因子基因表达的影响及机理。方法 筛选LKB1基因转染的MDA -MB - 4 35乳腺癌细胞 ,随机取样一株高表达细胞株和一株低表达细胞株 ,同时与未转染细胞株和空质粒转染细胞株比较。用RT -PCR观察促进微血管生成的因子的基因表达和分泌情况 ,并用Westernblot对其蛋白定量分析。并采用Tramswell试验 (Matrigel胶侵袭力检测法 )对其进行膜穿透能力检测。结果 无论从mRNA还是蛋白水平上分析LKB1转染的乳癌细胞的促进微血管生成的因子基因表达VEGF和bFGF较未转染细胞和空质粒细胞为低 ,且高表达LKB1的细胞较低表达者为低。相似的结果在Tramswell试验得到证实。结论 LKB1基因作为一种抑癌基因在乳腺癌细胞的侵袭和转移中起到重要作用 ,特别对促进微血管生成的因子作用不容忽视。

LKB1基因启动子甲基化与一例Peutz–Jegher综合征癌变的发生

目的:探讨一例Peutz-Jeghers息肉癌变的病因学分子机制。方法:提取患者大肠正常粘膜、非癌变息肉组织和癌变息肉组织石蜡切片的DNA,采用MSP检测LKB1基因启动子区域甲基化,免疫组化检测LKB1基因在组织中的表达。结果:发生癌变的息肉组织DNA检测到LKB1基因的甲基化,LKB1基因在息肉和正常肠粘膜组织未见甲基化。结论:甲基化状态的改变导致的基因表达沉默可能是其息肉发生癌变的机制。

LKB1基因在急性淋巴细胞白血病患者中的表达水平与病情的相关性

目的:探讨急性淋巴细胞白血病(ALL)患者体内LKB1基因的表达水平,分析患者病情与LKB1基因表达水平的相关性。方法:选择本院住院治疗的白血病患者98例,根据诊断结果的不同分为:ALL组56例,ANLL组42例。选取同时期50例健康体检者作为对照组。3组患者的静脉血分离单个核细胞,应用RT-PCR检测并比较各组的LKB1基因表达水平。根据ALL患者LKB1基因表达水平分为2个亚组:低表达组(39例),高表达组(17例)。随访3年,应用Kaplan-Meier法绘制2组ALL患者的OS及DFS曲线。比较2组CR及复发比例的差异。应用多因素Logistic回归分析影响ALL患者生存相关的危险因素。结果:LKB1基因表达水平对照组为1.56(1.38-1.74)>ALL组1.32(1.22-1.40)>ANLL组0.89(0.78-1.02),3组比较具有统计学差异(P<0.05)。与低表达组比较,高表达组CR率显著较高,而复发比例较低(均P<0.05)。随访3年,LKB1高表达的ALL患者OS和DFS率均优于LKB1低表达的ALL患者(P<0.05)。LKB1基因表达水平与ALL患者危险分层存在负相关(r=-0.712,P=0.039),其中标危ALL,LKB1基因低表达组患者显著少于高表达组(P=0.014),而高危ALL,LKB1基因低表达组患者显著高于高表达组(P=0.002)。多元Logistic回归分析显示,年龄(OR=2.872,P=0.020)、外周血幼稚细胞数(OR=2.268,P=0.028)为ALL患者生存相关的危险因素,而LKB1表达水平(OR=0.426,P=0.016)为保护因素。结论:ALL患者体内LKB1基因呈低表达水平,且表达水平越低ALL病情越严重,预后越差。

肺癌中LKB1基因变异的研究

目的：研究肺癌组织中肿瘤抑制基因LKBl的变异情况。方法：从34例肺癌患者手术切除的标本中提取基因组DNA，聚合酶链反应（PCR）扩增LKBl基因外显子3和外显子4-5，PCR产物经纯化后进行DNA测序分析。结果：34例肺癌患者手术切除的标本中均扩增出LKBl基因的外显子3及外显子4-5的靶基因片段，外显子4-5发现有4处变异，未发现外显子3的变异。结论：LKBl基因的变异可能是肺癌发生的关键因素。

LKB1基因对前列腺癌细胞增殖的影响

目的探讨LKB1/STK11(liver kinase B1/serine-threonine kinase 11)基因过表达对前列腺癌细胞增殖的影响及其可能机制。方法构建LKB1重组过表达稳转细胞株和阴性对照组稳转细胞株,同时加入空白对照组,通过q PCR法检测各组细胞中LKB1 mRNA的转录水平,Western blot法检测各组细胞中LKB1蛋白的表达水平,CCK-8法检测各组细胞系的增殖能力。结果 Western blot和q PCR法检测空白对照组、阴性对照组、LKB1组PC-3细胞中LKB1蛋白及mRNA的表达,结果显示LKB1组PC-3细胞中LKB1表达显著升高。CCK-8法检测空白对照组、阴性对照组、LKB1组PC-3细胞0、24、48、72 h各时间点的细胞活力,发现LKB1组PC-3细胞的生长活力于铺细胞24 h后开始,明显低于空白对照组及阴性对照组PC-3细胞,LKB1组PC-3细胞与空白对照组PC-3细胞相比,生长速度受到明显抑制。结论 LKB1基因过表达可以抑制前列腺癌细胞的增殖,LKB1是抑制前列腺癌细胞增殖分子机制的潜在靶点。

急性非淋巴细胞白血病患者骨髓中LKB1基因的表达水平及临床意义

目的探讨人类肝激酶B1 (Liver kinase B1,LKB1)基因在急性非淋巴细胞白血病(AML)患者骨髓中表达水平,及其与患者预后的相关性。方法选取2015年5月~2017年1月本院收治的90例AML患者标本为研究对象,同时选取非恶性血液系统疾病患者骨髓标本30例为对照组。采用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测各组骨髓中LKB1基因表达水平。Western Blot检测LKB1蛋白表达。Kaplan-Meier生存分析LKB1基因与AML预后的相关性。结果 AML患者骨髓中LKB1基因突变率、mRNA及LKB1蛋白表达量明显低于对照组(χ^(2)=13.274,t=34.134,P<0.05)。LKB1基因扩增率、mRNA表达量从高到低顺序M1(81%,17/21)>M5(78.6%,11/14)>M6(75%,3/4)>M2(42.4%,14/33)>M4(41.7%,5/12)>M3(35.3%,6/17)。LKB1高扩增组AML患者的随访生存率高于LKB1低扩增患者(χ^(2)=8.039,P<0.05)。LKB1高扩增组的中位生存时间高于LKB1低扩增组(27.3个月vs 19.8个月)(x^(2)=5.552,P<0.05)。LKB1高扩增组患者的化疗后感染、化疗后复率及髓外浸润发生率低于LKB1低扩增患者,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 AML患者骨髓中LKB1基因低扩增,且表达水平越低AML病情越严重,预后越差。

PTEN,LKB1基因缺失、突变检测对良恶性胸腔积液鉴别的意义

[目的]探讨检测PTEN,LKB1基因缺失、突变对鉴别良恶性胸腔积液的价值.[方法]提取漏出液组43例、良性胸腔积液组44例、恶性胸腔积液组47例患者胸腔积液中的DNA,采用PCR-SSCP法检测PTEN第5~8外显子、LKB1第1~9外显子缺失、突变情况.[结果]与漏出液组比较,良性胸腔积液组未发现PTEN,LKB1基因缺失或突变;恶性胸腔积液组PTEN基因总改变率为46.8%,LKB1基因总改变率为42.6%,联合检测PTEN,LKB1诊断恶性胸腔积液的灵敏度为78.7%,显著高于胸腔积液细胞学检查的53.2%（P〈0.05）.[结论]PCR-SSCP技术检测PTEN,LKB1基因缺失、突变可作为鉴别良恶性胸腔积液的辅助方法.

LKB1在子宫内膜样腺癌中的表达及意义

目的探讨抑癌基因LKB1在子宫内膜样腺癌及正常组织中的表达差异及其与肿瘤临床病理因素和微血管密度的关系。方法应用免疫组化方法检测LKB1在50例子宫内膜样腺癌和30例子宫内膜单纯性增生组织中的表达,并通过检测CD34在子宫内膜样腺癌的表达确定肿瘤微血管密度。结果 LKB1在子宫内膜样腺癌中的表达低于子宫内膜单纯性增生组织(P=0.033);在子宫内膜样腺癌中,LKB1的低表达与肿瘤细胞低分化、肌层浸润≥1/2及高微血管密度相关(P=0.022,P=0.035,P=0.030)。结论 LKB1能够抑制子宫内膜样腺癌的发生、新生血管形成及侵袭。

LKB1对胰腺癌细胞上皮间质转化及侵袭迁移的影响

目的探究LKB1基因对胰腺癌细胞上皮间质转化及侵袭迁移的影响情况。方法通过细胞实验检测LKB1过表达对胰腺癌上皮间质转化相关蛋白E-钙黏蛋白,及间质标记物N-钙黏蛋白、vimentin的影响,并分析其对人胰腺癌细胞PANC-1迁移和侵袭能力的影响。通过免疫荧光法对转染后的细胞进行处理,并通过荧光显微镜高倍镜观察细胞的变化情况。结果与空载体组、转染试剂组相比,LKB1过表达组中LKB1蛋白及E-钙黏蛋白表达水平显著升高(P<0.05);间质细胞标志物N-钙黏蛋白、Vimentin的蛋白相对表达水平明显降低(P<0.05)。LKB1过表达对胰腺癌细胞PANC-1迁移和侵袭能力的影响分别为转染试剂组(45.56±6.60)、空载体组(45.06±3.85)、LKB1过表达组(22.54±3.74);转染试剂组(111.48±14.90)、空载体组(107.58±13.18)、LKB1过表达组(57.48±7.94);LKB1过表达组细胞迁移和侵袭能力均显著降低(t=-14.501、-14.824、-12.810、-13.808,P均=0.000)。结论 LKB1可以抑制人胰腺癌细胞的迁移和侵袭,该抑制过程可能与其参与上皮间质转化有关。

联合检测支气管肺泡灌洗液中DPC4和LKB1突变诊断肺部孤立块影的价值

目的探讨联合检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中DPC4和LKB1突变对鉴别肺部X线孤立块影良恶性的价值。方法选择X线检查有肺部孤立块影的患者49例,其中非小细胞肺癌（NSCLC）患者39例,非癌对照组10例,用聚合酶链式反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）法检测BALF中DPC4第8-11外显子、LKB1第1-9外显子的突变情况。结果 39例NSCLC患者中DPC4缺失3例,突变12例,LKB1突变10例,1例NSCLC患者同时发生DPC4和LKB1突变,非癌对照组均未检测出抑癌基因缺失或突变。联合检测DPC4和LKB1诊断NSCLC的灵敏度（61.5%,24/39）较单独检测DPC4或LKB1显著增高（P〈0.05）。结论用PCR-SSCP技术检测BALF中DPC4或LKB1基因突变可作为鉴别肺部孤立块影良恶性的辅助指标之一,有助于肺癌的早期诊断和分期,可能具有一定的临床应用价值,联合检测两种基因较单独检测灵敏度更高。