抑瘤基因NGX6对鼻咽癌细胞株HNE1细胞生长的影响(英文)

鼻咽癌是我国南方多发恶性肿瘤 ,它的发生发展与遗传因素密切相关 .采用定位候选克隆策略在 9p上克隆出一个候选抑瘤基因 ,命名为NGX6 .为了进一步研究它的功能 ,将NGX6基因的全长cDNA片段亚克隆至pcDNA3.1(+ )的表达载体中 ,通过脂质体转染入鼻咽癌细胞系HNE1中 ,Northern杂交方法筛选高效表达NGX6的细胞株 ,并借助细胞生长曲线、软琼脂糖集落形成实验、裸鼠体内接种实验和流式细胞仪对转染细胞的生物学行为进行了检测 .结果显示 ,转染了NGX6基因的HNE1细胞的生长速度明显减慢 ,在软琼脂中集落形成率较对照组显著下降 (P〈0 0 5 ) ,裸鼠体内成瘤的时间较对照组明显延长 ,瘤体的大小和重量较对照组明显减少 ,流式细胞仪检测发现细胞的凋亡率无明显变化 .为了明确NGX6蛋白在细胞中发挥作用的部位 ,进一步将NGX6的开放阅读框架完整正确地克隆到pEGFPC1的荧光载体中 ,转染到COS7细胞中 ,用荧光显微镜观察细胞中荧光的分布 ,发现荧光主要分布在细胞浆中 ,说明NGX6蛋白可能是一种胞浆蛋白 .该研究表明 ,NGX6在NPC的发生发展中起重要作用 ,为全面阐述NGX6的功能提供重要的信息 。

人鼻咽癌相关基因NGX6在大肠杆菌中的诱导表达及纯化

NGX6是一个新克隆的鼻咽癌抑瘤基因候选者,为了进一步制备抗NGX6编码蛋白质的抗体和研究它的功能,本研究拟在原核表达系统中表达并纯化出NGX6蛋白.采用多聚酶链式反应(PCR)方法扩增出NGX6基因蛋白编码序列,构建该基因的融合表达质粒pGEX3X NGX6,导入大肠杆菌中,IPTG诱导表达,SDS PAGE电泳,Westernblot鉴定.用GST融合蛋白纯化试剂盒纯化融合蛋白.结果显示构建的融合表达质粒酶切和测序鉴定阅读框架正确,导入大肠杆菌中诱导后出现一条42kDa的新蛋白带,主要存在于细菌沉淀中,占总蛋白的26%,Westernblot鉴定其为GST NGX6融合蛋白,并进一步纯化出融合蛋白.研究表明NGX6基因编码蛋白质能够在原核细胞中表达,并能纯化出该种蛋白,为进一步深入研究该蛋白质的结构与功能打下了基础.

抑瘤基因NGX6对人结肠癌细胞凋亡的影响

NGX6基因是中南大学肿瘤研究所分子遗传室在对鼻咽癌研究中筛选克隆出的一个新基因.以稳定转染并表达NGX6基因的HT-29细胞为实验组,转染空白质粒的HT-29细胞以及HT-29细胞为对照组,利用PI/Annexin-V双染流式细胞仪检测结肠癌细胞的凋亡情况,通过EMSA分析体外培养的结肠癌细胞及种植瘤细胞内核转录因子-κB(NF-κB)的激活情况.研究结果表明:在裸鼠结肠癌种植瘤中,转染了NGX6基因的与未转染及空白载体组比较,结肠癌细胞凋亡率明显增高;EMSA(electrophoretic mobility shift assay)分析体外培养的结肠癌细胞及种植瘤细胞内核转录因子-κB(NF-κB)的激活情况,发现转染了NGX6基因的细胞NF-κB的激活均明显受到抑制.此研究说明,NGX6基因具有诱导结肠癌细胞凋亡的能力,其可能的机制是抑制了结肠癌细胞NF-κB的激活.

抑瘤基因NGX6对人结肠癌细胞HT-29生长的影响

目的:NGX6是新克隆的侯选抑瘤基因,其在结肠癌组织中表达明显下调,提示NGX6的差异表达与结肠癌发生有关.本文通过研究NGX6对人结肠癌细胞HT-29生物学特性的影响以明确NGX6在结肠癌发生发展中的作用. 方法:脂质体介导pcDNA3.1(+)/NGX6重组体转染低表达NGX6的人结肠癌细胞HT-29,Dot blot及RT-PCR方法检测外源性NGX6基因的表达,借助生长曲线、MTT、软琼脂集落形成、流式细胞仪、裸鼠成瘤实验对NGX6转染前后人结肠癌细胞HT-29的生物学行为进行检测. 结果:pcDNA3.1(+)/NGX6/HT-29组细胞生长速度比pcDNA3.1(+)/HT-29和HT-29组明显减慢(P<0.05),其倍增时间为34.5 h比pcDNA3.1(+)/HT-29(27.1 h)和HT-29 (23.0 h)延长;pcDNA3.1(+)/NGX6/HT-29组软琼脂集落形成率较对照组明显下降(P<0.05);流式细胞仪检测NGX6高表达能延缓HT-29细胞周期由G0/G1期→s期的进程;裸鼠成瘤实验表明pcDNA3.1(+)/NGX6/HT-29组成瘤受抑. 结论:NGX6的重表达可逆转人结肠癌细胞HT-29的恶性表型;NGX6是极具前途的结肠癌相关抑瘤基因侯选者.

抑瘤基因NGX6对结肠癌血管形成的影响

目的:探讨抑瘤基因NGX6对结肠癌血管形成的影响.方法:将HT-29细胞分为3组:pcDNA3.1(+)/NGX6/HT-29组(稳定转染并表达NGX6基因的HT-29细胞)、pcDNA3.1(+)/HT-29组(转染空白质粒的HT-29细胞)及HT-29对照组.通过鸡胚绒毛尿囊膜血管形成实验检测结肠癌细胞接种鸡胚血管形成情况.裸鼠成瘤实验观测种植瘤及其对裸鼠的影响,然后对种植瘤进行免疫组织化学实验检测其内部血管生成.RT-PCR检测NGX6基因及VEGF基因在各组细胞中的表达.结果:pcDNA3.1(+)/NGX6/HT-29组鸡胚血管形成平均数量较HT-29与pcDNA3.1(+)/HT-29组明显减少(6.2±0.2vs8.6±0.2,8.4±0.3,P<0.05);HT-29组裸鼠明显消瘦且pcDNA3.1(+)/NGX6/HT-29组与HT-29和pcDNA3.1(+)/HT-29组种植瘤平均质量、种植瘤微血管密度明显降低(1.83±0.25gvs4.06±0.20g,4.16±0.4g;1.83±0.52vs7.36±1.12vs6.96±1.43,均P<0.05);VEGF在pcDNA3.1(+)/NGX6/HT-29细胞及种植瘤中较其余两组明显降低,而pcDNA3.1(+)/HT-29细胞与未转染的HT-29细胞与种植瘤中呈高表达;且HE染色切片显示HT-29组及PcDNA3.1(+)/HT-29组种植瘤血管内都有癌栓,而PcDNA3.1(+)/NGX6/HT-29组种植瘤内未见有癌栓形成.结论:NGX6基因能抑制结肠癌细胞HT-29血管的形成,抑瘤基因NGX6的抑癌能力部分是通过抑制血管形成来实现的.

双向电泳和质谱技术研究鼻咽癌候选抑瘤基因NGX6的功能

目的：NGX6基因是我室克隆的与鼻咽癌相关的肿瘤抑制候选基因,它的功能与作用机制目前尚不清楚。方法：通过亚克隆的方法将NGX6 cDNA 片段克隆至pcDNA3.1(＋)的表达载体，经脂质体导入HNE1细胞,采用双向凝胶电泳分离细胞内蛋白质，筛选差异表达的蛋白质点进行质谱分析和生物信息学资料处理。结果：我们鉴定出7种表达下调的蛋白质，其中包括RAB蛋白、NG24前体、LIM同源盒9等。这些蛋白参与了细胞生长、增殖和分化的信号传导通路。结论：这些结果说明NGX6基因可能通过多种途径影响鼻咽癌的生长。本文为研究NGX6的作用机制提供了很好的实验资料，对鼻咽癌的基因治疗奠定了一定的研究基础，也为研究其他基因的作用机制提供了新思路。

NGX6基因对高转移鼻咽癌细胞株5-8F细胞的影响

NGX6是一个新克隆的鼻咽癌候选抑瘤基因.为进一步研究其功能,在构建NGX6的真核表达载体NGX6/pcDNA3.1(+)基础上,通过脂质体转染方法将NGX6基因导入鼻咽癌细胞株SUNE-1的亚株5-8F细胞(具高成瘤高转移潜能)中,并用RT-PCR和RNA印迹鉴定,建立了稳定表达NGX6基因的5-8F细胞系.借助细胞生长曲线、软琼脂集落形成实验对转染细胞的生物学行为进行了检测,同时采用包含1176个与肿瘤学相关的基因cDNA微阵列,分析了NGX6基因转染对5-8F细胞基因表达谱的影响.结果显示:转染了NGX6基因的5-8F细胞的生长速度明显减慢,在软琼脂中集落形成率较对照组显著下降(P<0.05),发现NGX6基因的转染能够上调5-8F细胞中p19、cateninα2、desmoglein1等基因的表达,同时下调EphB4、TIE2、vitronectin等基因的表达.综上所述,NGX6基因可以抑制5-8F细胞的恶性生物学行为,并影响一些与细胞周期、细胞黏附和血管生成有关的基因的表达.上述结果为鼻咽癌转移分子机制的阐明提供了重要的线索.

NGX6基因在多种常见癌组织中的原位表达及其临床意义的研究

研究新的候选抑瘤基因NGX6在多种常见癌组织中的mRNA原位表达谱,分析NGX6 mRNA阳性率与肿瘤临床病理特征的关系并评估其作为肿瘤转移、预后预测分子标志物的有效性.利用已制作的多肿瘤组织和鼻咽癌组织微阵列,原位杂交检测NGX6 mRNA在多种常见癌组织中的阳性率.结果显示,NGX6 mRNA在鼻咽癌、肺癌、胃癌和结、直肠癌中的阳性率低于其对应的正常组织(P<0.05,P<0.01).淋巴结转移性鼻咽癌、肺癌、结、直肠癌和喉癌组织中的NGX6 mRNA阳性率显著降低(P<0.05,P<0.01).NGX6 mRNA阳性率与鼻咽癌、肺癌和结、直肠癌临床分期有关,临床Ⅱ期、Ⅲ期或Ⅳ期癌组织NGX6 mRNA阳性率明显低于其相应的临床Ⅰ期癌(P<0.05,P<0.01).研究表明,鼻咽癌、肺癌、胃癌和结、直肠癌中存在低水平的NGX6 mRNA,NGX6 mRNA可作为鼻咽癌、肺癌和结、直肠癌侵袭、转移和临床进展预测的分子标志.

NGX6对结肠癌细胞系HT-29基因表达谱的影响

背景与目的:结肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,其发病机制仍未完全明了。本研究在前期工作的基础上探讨候选抑瘤基因NGX6对结肠癌细胞系HT-29基因表达谱的影响。方法:通过脂质体介导的基因转染构建稳定表达NGX6的结肠癌细胞系pcDNA3.1(+)/NGX6/HT-29,以NGX6转染组为实验组,空白质粒转染组为对照组,利用高通量的表达谱芯片BiostarH-80sx1筛选差异表达基因,RT-PCR验证部分基因芯片的实验结果。结果:NGX6基因转染结肠癌细胞系HT-29后引起该细胞系基因表达谱广泛地改变,其中表达差异3倍以上的基因共377个,这些差异表达基因的功能涉及多个方面,包括细胞信号转导﹑细胞周期调控﹑细胞凋亡﹑细胞骨架和运动﹑基因转录和翻译、DNA损伤修复﹑蛋白质合成和代谢等。其中包括一些非常重要的信号转导通路上的分子改变,如Wnt/β-catenin信号通路上的DKK1、ILK、MMP1、COL11A1,ILK信号通路上的ILK,Eph-Ephrins信号通路上的EpHB2,RhoA信号通路上的ROCK2,RanGTPase信号通路上的RANBP1,以及RB/RBBP1信号通路上的RBBP1等。结论:NGX6转染引起了一些非常重要的信号转导通路上的分子改变,可能通过参与调节这些信号转导通路而发挥其抗肿瘤增殖和转移的作用。

NGX6基因抑制高转移鼻咽癌细胞的侵袭运动能力

NGX6基因是我室利用定位候选克隆策略,在鼻咽癌的高频杂合性缺失区9p21-22克隆的新基因.前期研究结果提示,它与鼻咽癌细胞的侵袭转移密切相关.为了进一步阐明其作用的结构基础,本研究成功构建了含NGX6基因及突变体的pCMV-myc瞬时和pcDNA3.1-his-myc(-)B稳定表达载体.通过脂质体转染技术,构建了NGX6及突变体的稳定表达细胞系5-8F.用免疫荧光试验和免疫电镜观察了NGX6在5-8F细胞中的亚细胞定位主要位于胞膜、核膜以及胞浆中的膜质结构,缺失突变的功能域对其定位没有明显的影响.基质胶侵袭试验和划痕试验研究了NGX6及突变体对细胞运动的影响.NGX6能抑制高转移潜能的鼻咽癌细胞5-8F的运动和侵袭能力,缺失胞内区(CYTO)后NGX6不能抑制5-8F细胞的运动和侵袭,提示CYTO可能是其发挥作用的重要功能域.

NGX6基因在肝细胞癌中的表达及意义

目的:探讨NGX6基因在肝细胞癌及癌旁组织中有无表达及其与临床病理特征的关系。方法:肝细胞癌患者组织标本分为癌与癌旁对照组,应用RT-PCR检测45例肝细胞癌及配对癌旁组织NGX6表达,并对其表达和各临床病理参数的关系进行分析。结果:癌组织NGX6阳性表达率35.5%(16/45),NGX6表达强度相对值为0.245±0.060;癌旁组织阳性表达率为77.8%(35/45),强度相对值为0.352±0.113;癌与癌旁组织的表达阳性率及强度比较差异有统计学意义(P<0.05);肝细胞癌组织NGX6表达与TNM分期(χ2=6.106,P=0.042)、淋巴结转移(χ2=5.237,P=0.022)有关。结论:NGX6基因转录水平的表达降低或缺失,可能在原发性肝细胞癌的发生过程中起了重要作用,NGX6基因表达水平有可能作为一项早期预测肝癌发生发展的指标。

NGX6基因联用5-Fu对人结肠癌细胞凋亡的影响

目的:探讨侯选抑瘤基因NGX6联用5-Fu对结肠癌细胞凋亡的影响。方法:以稳定转染并表达NGX6基因的HT-29细胞与5-Fu联用作为实验组,以PDTC与5-Fu联用的HT-29细胞作为对照组,通过EMSA检测各组结肠癌HT-29细胞核转录因子-κB(NF-κB)的激活情况,利用MTT比色法检测各组细胞增殖的情况,吖啶橙(AO)/溴化乙啶(EB)双染法显微镜观测以及PI/Annexin-V双染流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。结果:稳定转染并表达NGX6基因的HT-29细胞以及应用了PDTC的HT-29细胞NF-κB的激活均明显受到抑制;与5-Fu作用的HT-29细胞组比较,5-Fu联合PDTC作用于HT-29细胞后,HT-29细胞增殖受到明显抑制,5-Fu诱导HT-29细胞凋亡作用增强;与5-Fu联合PDTC作用于HT-29细胞的对照组比较,在诱导细胞凋亡以及抑制细胞增殖方面,稳定转染并表达NGX6基因的HT-29细胞与5-Fu联用组和对照组所取得一致的效果,NGX6基因增强5-Fu对HT-29细胞增殖抑制的能力及诱导HT-29细胞凋亡的能力。结论:NGX6基因抑制了肿瘤细胞NF-κB的激活,具有增强5-Fu诱导结肠癌细胞凋亡的能力,其机制可能是抑制肿瘤细胞NF-κB的激活,NGX6基因对肿瘤的治疗及预后起积极作用。

NGX6基因联合顺铂治疗肺癌的体内外研究

目的探讨NGX6基因联合顺铂对肺癌A549细胞和NCI-H1975细胞的体外抑制作用及其体内抗肿瘤效果。方法以脂质体鱼精蛋白为载体,构建载NGX6基因的阳离子脂质体-DNA复合物。将A549细胞和NCI-H1975细胞均分为NGX6组(载NGX6基因的LPD,NGX6浓度为30μg/m L)、顺铂组、NGX6+顺铂组,以PBS为阴性对照。采用MTT检测各组对A549细胞和NCI-H1975细胞的生长抑制作用;克隆形成实验计算克隆形成率和抑制率;构建肺癌移植肿瘤模型,将裸鼠分为同细胞处理相同的4组,每组10只,统计各组裸鼠肿瘤体积和生存期,观察各组裸鼠肿瘤组织细胞凋亡情况。结果对肿瘤细胞的增殖抑制能力显著强于NGX6组和顺铂(P<0.01)。克隆形成实验结果表明,NGX6+顺铂组的肿瘤细胞克隆数小于NGX6组和顺铂组(P<0.01)。体内抗肿瘤实验结果表明,NGX6+顺铂组对荷瘤裸鼠的肿瘤生长抑制率显著高于NGX6组和顺铂组(P<0.01)。NGX6+顺铂组,NGX6组,顺铂组和生理盐水组荷瘤裸鼠的中位生存期分别为43、31、29、15d。结论 NGX6基因联合顺铂能够有效抑制肺癌细胞的增殖和肿瘤的生长。表明基因干预联合细胞毒性药物化疗能为肿瘤的治疗提供了一种新的治疗手段。

NGX6基因在结直肠癌中的表达及其与微卫星不稳定的关系

目的探讨NGX6基因在结直肠癌及癌旁组织中表达情况及其与临床病理和微卫星不稳定的关系。方法应用RT-PCR检测41例结直肠癌组织及配对癌旁组织NGX6表达,并对其表达和各临床病理参数的关系进行分析。结果癌组织NGX6阳性表达率21.95%(9/41),NGX6表达强度相对值为0.16±0.08;癌旁组织阳性表达率为65.85%(26/41),强度相对值为0.35±0.15;癌与癌旁组织的表达阳性率及强度比较差异有统计学意义(P<0.05);结直肠癌组织NGX6表达与TNM分期(P<0.01),但与年龄、性别、淋巴结转移、CEA状态、微卫星状态均无关(P>0.05)。结论 NGX6基因在结直肠癌发生发展中可能扮演抑癌基因的作用,作用机制与微卫星不稳定无关,需要进一步研究。

NGX6基因两转录本在不同分期结直肠癌中的表达及与癌胚抗原的关系(英文)

目的:探讨NGX6mRNA两种转录本NGX6-S和NGX6-L在结直肠癌中的表达及功能。方法:采用原位杂交法检测NGX6-L和NGX6-S在不同分期结直肠癌癌组织及其配对正常组织中的表达特征,并分析其与血清癌胚抗原(CEA)的相关性。结果:在结直肠癌组织中短转录本NGX6-S的表达明显高于长转录本NGX6-L(P=0.008)。NGX6-S和NGX6-L在不同分期结直肠癌癌组织中的表达差异均无统计学意义(P>0.05)。NGX6-S在Duke A,B和C三期结直肠癌组织中的表达与其在配对正常组织的表达差异无统计学意义(P>0.05),在有远处转移的Duke D期结直肠癌组织中的表达低于配对正常组织(P=0.033)。NGX6-L在Duke A,B,C和D期结直肠癌组织中的表达与配对正常组织差别无统计学意义(P>0.05)。结直肠癌中NGX6-S,NGX6-L的表达与血清CEA浓度无相关性。结论:在结直肠癌中NGX6基因发挥抑瘤功能的主要形式是短转录本NGX6-S,其表达下调可能与结直肠癌的远处转移相关。

结肠癌中NGX6抑制EGFR/K-ras/JNK/c-Jun/cyclin D1信号通路的研究

候选抑瘤基因NGX6具有抑制结肠癌增殖和转移的作用,研究表明其为表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的负性调控因子,并可下调JNK通路中重要分子MADD(MAP-kinase activating death domain)的表达,其抑瘤机制是否与抑制EGFR介导的JNK信号通路的活性有关?在已建立的转染NGX6的细胞模型基础上,借助蛋白质印迹(Western blot)和免疫组化方法在细胞和组织水平检测NGX6转染前后EGFR/K-ras/JNK/c-Jun/cyclin D1信号通路中重要蛋白质的表达.结果表明,NGX6转染后结肠癌细胞HT-29在裸鼠体内成瘤明显受抑,差异有统计学意义.Western blot结果显示,在结肠癌细胞中NGX6可明显下调EGFR、K-ras、p-JNK、c-Jun和cyclin D1的表达;进一步采用Western blot和免疫组化法验证NGX6在体内对上述关键分子表达的影响,发现NGX6可抑制裸鼠移植瘤组织中EGFR、K-ras、p-JNK、c-Jun和cyclin D1的表达,与体外结果一致.上述研究表明,NGX6在结肠癌中主要通过抑制EGFR介导的JNK通路的活性而发挥其抑瘤作用,该研究为深入探讨NGX6的机制提供了重要的实验依据.

裸鼠脾脏移植瘤模型在NGX6抗结肠癌转移作用研究中的应用

目的:建立结肠癌肝转移模型,为抑瘤基因NGX6功能研究提供体内试验平台。方法:将低分化结肠癌细胞系HT-29组(HT-29)、空白质粒转染组[pcDNA3.1(+)/HT-29]、NGX6转染组[(pcDNA3.1(+)/NGX6/HT-29)]细胞分别接种于裸鼠脾脏下极包膜内,每天称量裸鼠体质量并观察裸鼠摄食、活动及精神情况,45d后处死裸鼠,分别从大体水平以及镜下观察肝、脾、肺、肾、脑等器官肿瘤转移情况。结果:pcDNA3.1(+)/NGX6/HT-29组裸鼠较其他两组裸鼠肝脏转移灶数目明显减少、脾脏上种植瘤形成明显减少。结论:抑瘤基因NGX6抑制结肠癌HT-29细胞的转移,裸鼠脾内种植转移模型可作为新基因体内功能研究的理想模型。

NGX6对Wnt/β-catenin通路β-catenin/TCF/LEF转录活化的影响

目的:探讨NGX6基因对结肠癌Wnt信号转导通路β-catenin/TCF/LEF转录活化的影响,明确NGX6在Wnt/β-catenin信号转导通路中的作用机制。方法:(1)构建β-catenin野生型真核表达载体pcDNA3.1(+)-β-catenin(WT),(2)转染外源性pcDNA3.1(+)-β-catenin(WT)及pCMV-myc-NGX6于COS-7细胞,TCF-4荧光素酶报告质粒检测转染NGX6前后TCF-4的转录活性。(3)无外源性β-cate-nin,pCMV-myc-NGX6单独转染COS-7细胞及结肠癌SW620细胞,TCF-4荧光素酶报告质粒检测TCF-4的转录活性,并采用Western blot的方法检测两组细胞核内β-catenin及TCF-4的表达。结果:(1)成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-β-catenin(WT);(2)pcDNA3.1(+)-β-catenin(WT)与pCMV-myc-NGX6共转染COS-7细胞较pcDNA3.1(+)-β-catenin(WT)单独转染时TCF-4荧光素酶活性明显下降(P<0.05);(3)无外源性β-catenin,pCMV-myc-NGX6转染COS-7及SW620细胞后TCF-4荧光素酶活性较空白质粒转染组下降(P<0.05);(4)NGX6转染COS-7及SW620后核内β-catenin及TCF-4的表达下降。结论:NGX6对结肠癌中Wnt/β-catenin通路的β-catenin/TCF/LEF转录活化具有负性调节作用,其作用机制可能与NGX6抑制β-catenin的核转位有关。