家蚕食性突变的研究 第9报 诸桂食性突变基因Nps的连锁检索

一、材料和方法 Nps来源于登载在《蚕研汇报》第34号第1表系统表a中的S2。文章中介绍此系统是这样产生的:用IOOR/min的60Coγ-射线对诸桂雄蛹照射5 KR,羽化后与不照射的诸桂雌交配,G1代得到24733头蚕,这些蚕用甜菜叶筛选获得了雄性食性变异个体,将这些个体再与不经照射诸桂雌交配,所得G2代再用甜菜叶进行摄食试验。此后每代都进行同样的试验以维持系统。

内含埃博拉病毒NP基因序列假病毒粒子的构建及应用

目的:构建内含埃博拉病毒(EBOV) NP基因序列的假病毒粒子,建立EBOV Taqman实时荧光定量PCR检测方法。方法:对埃博拉病毒的NP基因序列进行分析,分析基因是否包含重复序列,复杂二级结构以及高GC含量等;根据序列分析结果,合成NP全基因序列,并将NP基因的序列克隆至慢病毒包装载体pGWLV-pseudovirus中,转化DH5α感受态细胞,筛选得到阳性克隆pGWLV-NP质粒。将重组质粒转染293T 细胞,培养48 h后进行除菌,纯化后获得高纯度假病毒,通过RT-PCR鉴定该假病毒粒子含有EBOV NP基因。通过荧光定量qPCR对假病毒颗粒进行计数后,利用本研究所获得的假病毒颗粒制备用于EBOV核酸检测的标准品。结果:建立了基于EBOV NP基因的Taqman荧光定量PCR检测方法。本研究建立的基于包含NP基因的EBOV假病毒核酸cDNA的Taqman荧光定量PCR检测方法的Ct值与核酸cDNA标准品1 × 109~1 × 101个/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数可达到0.99。结论:该方法所用标准品模拟了真实病毒粒子的结构,无生物传染性,经检测均匀性和稳定性良好,可作为EBOV核酸检测的阳性标准质控品,实现对核酸检测的全程监控。

新城疫病毒F_(48)E_9株M NP F和HN基因的真核表达

将新城疫病毒(NDV)F48E9株的M、NP、F和HN基因克隆到真核细胞表达载体 pCAGG上,经酶切、PCR鉴定和序列分析,分别筛选出了含有M、NP、F和HN基因的重组质粒, 命名为pCAGG-M、pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGG-HN。纯化后的重组质粒通过脂质体单独转染HeLa细胞,经间接免疫荧光试验检测到了M、NP、F和HN蛋白的表达。pCAGG-M、 pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGG-HN重组质粒组合共转染HeLa细胞48 h后,可以观察到明显的细胞融合现象。试验结果表明,NDV F48E9株的M、NP、F和HN蛋白均在HeLa细胞内得到了成功表达,同时证明在该表达系统中F蛋白不足以诱导细胞融合。

猪博卡病毒NP1基因的克隆与原核表达

猪博卡病毒是近年来新发现的一种细小病毒。本研究根据其部分基因组序列(GenBank登录号GU902967-GU902971)设计了一对引物,采用PCR方法扩增出了猪博卡病毒的NP1基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中,构建了重组质粒pET32a-NP1,经测序鉴定正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3)中,并进行IPTG诱导表达。结果表明,重组菌可表达分子量为46 kDa的融合蛋白,蛋白表达量较高,而且蛋白以可溶性形式存在于菌体中。表达产物经纯化后,目的蛋白纯度较好。Western Blot结果显示,表达的NP1蛋白能与His抗体发生特异性的免疫反应,表明原核表达的NP1蛋白具有良好的反应原性。

新城疫病毒F48E9株M和NP基因的原核表达

根据新城疫病毒(NDV)F48E9国内标准强毒株编码序列设计了2对特异性引物,分别用于扩增M和NP基因。经序列测定,将其克隆到原核表达载体pET-30a(+)上,转化E.coliBL21(DE3),筛选表达NDV F48E9株M蛋白和NP蛋白的菌株。IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析结果表明,NDV M蛋白在E.coliBL21(DE3)内以可溶形式存在,而NP蛋白以包涵体的形式表达。用纯化的M和NP蛋白免疫鸡制备超免疫血清,进行Western-blot分析;结果,它们可以与真核表达系统表达的M和NP蛋白以及NDV发生特异性反应,表明,原核表达系统表达的NDV M和NP蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。

NP9基因的克隆及对细胞周期素D1转录活性的影响

背景与目的:NP9基因是我们在鼻咽癌中克隆到的一个新的表达下调的基因(GenBank登录号:BF718797),为了进一步研究该基因的功能,我们构建了人NP9基因编码区序列的真核表达质粒,并研究其表达对细胞周期素D1(cyclinD1)的影响。方法:通过核苷酸同源序列比较(BlastN)得到NP9EST的同源cDNA,RT-PCR扩增其编码区序列并构建真核表达重组质粒pRc/CMV2-NP9,脂质体转染后G418筛选出稳定、高效转录NP9基因的细胞克隆;再通过脂质体转染cyclinD1promoterLuc和NF-κB-Luc质粒到稳定表达NP9基因的细胞克隆,测定荧光素酶的活性以确定NP9基因对cyclinD1和NF-κB转录活性的影响;同时亚克隆NP9基因编码序列到载体pEGFP-C1中,脂质体转染细胞以确定NP9蛋白在细胞中的定位。结果:融合的绿色荧光蛋白出现于细胞核。G418抗性克隆中,RT-PCR扩增证实部分克隆表达NP9基因,且强弱不同。表达NP9基因的细胞克隆在瞬间转染cyclinD1promoterLuc和NF-κB-Luc48h后,荧光素酶的活性较其对照组分别下降46%和63%。结论:NP9蛋白在细胞核内表达;NP9基因通过抑制核转录因子NF-κB的转录活性下调cyclinD1的表达。

NP1和GAFP双价抗病基因植物表达载体的构建

防御素对病毒、细菌和真菌都具有一定的抗性。天麻抗真菌蛋白可抑制多种真菌的生长。笔者利用DNA重组技术,将这两个抗病机制不同、抗菌谱均较广的抗病基因(天麻抗真菌蛋白GAFP和防御素NP1基因)构建在一个植物表达载体pBinGAFP-NP1上,为一次性地获得含双价抗病基因的植株奠定了基础。

H1N2亚型猪流感病毒HA、NP、NA、M和NS基因的克隆与序列分析

对3株H1N2亚型猪流感病毒（SIV）：Sw／GX／17／05、Sw／HN／I／05和Sw／GX／13／06的血凝素（HA）、核蛋白（NP）、神经氨酸酶（NA）、基质蛋白（M）和非结构蛋白（NS）基因进行克隆和序列分析。结果显示：3株分离毒株HA、NP、NA、M和NS基因之间核苷酸同源性分别为91．3％～98．0％、98．4％～98．8％、97．4％～98．3％、98．8％～99．8％和98．1％～98．4％。遗传进化分析显示：分离毒株与美国分离的三源基因重排HIN2sIV具有较近的亲缘关系；在HA、NP、M和NS基因进化树中，3株分离毒株均位于古典H1N1亚型SIV群，在NA基因进化树中，3株分离毒株则位于人流感病毒群。HA和NA基因推导氨基酸序列分别与代表毒株古典H1N1SIVA／swine／Maryland／23239／1991（H1N1）和人H3N2流感病毒A／BuenosAires／4459／96（H3N2）比较分析显示：HA（95．4％～96．1％）和NA（96．6％～97．2％）具有较高的氨基酸同源性；糖基化位点、抗原位点和受体结合位点（HA）处氨基酸存在一定的差异，这些氨基酸差异对病毒生物学特性的影响有待于进一步研究。

猪流感病毒NP基因的克隆及杆状病毒转移载体的构建

本研究通过RT-PCR扩增了猪流感病毒A/Swine/Inner Mongolia/547/01(H3N2)的NP基因,并将其克隆入pMD18-T载体。重组pMD18-T经SalI和EcoR I酶切后得到的NP基因插入pMelBacB载体的SalI/EcoRI位点。PCR和限制性内切酶分析鉴定表明成功构建了pMelBacB-NP转移载体。这为开发NP诊断抗原和亚单位疫苗奠定了基础。

环境胁迫和乙烯对番茄PR-NP24基因表达的影响

根据已报道的番茄PR-NP24基因序列设计引物,经PCR克隆出长为477bp的番茄PR-NP24基因片段,以该片段制备探针,采用Northern杂交技术对该基因在番茄(WT)和乙烯反应突变体番茄(Nr,rin,T4B-11)中的表达进行了研究.杂交结果表明,该基因主要在果实和根部表达,伤害抑制WT、Nr番茄叶片中该基因的表达,而对rin番茄叶片无明显影响;干旱、淹水等环境胁迫和乙烯均能不同程度地诱导其表达,而在不同温度下,PR-NP24基因表达变化不大.

鸭源新城疫病毒NP基因在昆虫细胞中的表达及抗原性检测

为在昆虫细胞中表达鸭源新城疫病毒NP蛋白质,首先根据鸭源新城疫病毒NP基因序列设计引物,扩增出NP基因,将其克隆至杆状病毒表达载体p Fast Bac1,获得重组转移载体p Fast Bac-NP,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒r Bacmid-NP,在脂质体的介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒NP蛋白质。Western blot、间接免疫荧光试验结果均显示表达的重组蛋白质能够与全病毒阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。以上结果说明鸭源新城疫病毒NP蛋白质在昆虫细胞中获得了成功表达。

应用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法检测人工感染雏鸭体内DEV NP基因表达水平

为阐明DEV的感染与致病机理,更深入地研究病原与鸭体的相互关系。将鸭肠炎病毒(DEV)强毒GZ株经腿部肌肉注射感染15日龄雏鸭后,应用建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法对NP(病毒核衣壳蛋白)基因转录物进行定量,以检测NP基因在雏鸭体内各组织的表达水平。结果显示:NP基因在所检组织中均有表达,感染后3 h即可在肝、脾、脑、胸腺、肾和肺6种组织中检测到NP基因的表达;感染后6 h,除上述组织外还可在十二指肠和盲肠检测出;感染后10 h又可在胸肌和心肌等检测出。不同受检组织检出量有所不同,且在感染后30或48 h达到高峰,持续至96 h,之后均有所下降。

鹅源新城疫病毒NP、P和L基因的克隆与P基因的表达鉴定

将鹅源新城疫病毒的NP、P和L基因通过RT PCR方法从尿囊液中扩增后分别克隆进pGEM Teasy载体 ,再分别亚克隆到真核表达载体pCI neo上 ,通过酶切、PCR和测序验证克隆正确。利用P基因开放性阅读框 (ORF)上靠近终止密码上游的AgeI位点 ,将报告基因绿色荧光蛋白 (GFP)基因克隆进P基因真核表达重组质粒 ,分别转染COS 1细胞和CEF细胞 ,在倒置荧光显微镜下可见到绿色荧光 ,表明GFP基因已得到表达 ,由此证明P基因也已得到表达。鹅源新城疫病毒NP、P和L基因的克隆成功 。

4株不同亚型流感病毒NP基因的原核表达

为了进一步研究A型流感病毒核蛋白功能及在诊断中的应用,采用RT-PCR技术分别扩增H1N1、H3N2、H5N1、H9N2等4株不同亚型流感病毒的NP基因,分别将其克隆到原核表达载体pET30(a)上,在大肠埃希菌中进行诱导表达。SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,H1N1亚型流感病毒NP蛋白得到表达,并且能分别与H1N1和H5N1亚型流感病毒的鼠高免血清发生特异性反应,具有良好的反应活性;而H3N2、H5N1、H9N2亚型流感病毒的重组NP蛋白未获得表达。本研究结果表明,不同毒株的NP蛋白在大肠埃希菌中的表达具有一定差异性,为把NP蛋白作为诊断抗原的开发、ELISA诊断方法的建立以及蛋白功能的研究奠定了基础。

犬博卡病毒非结构基因NP1多克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备犬博卡病毒(MVC)的非结构基因NP1的兔多克隆抗体,并进行特异性鉴定。方法:以MVC的感染性克隆pI-MVC为模板,构建NP1基因的原核表达质粒pGEX-4T-3-NP1,转化大肠杆菌BL21后,在异巯基-1-硫代-β呋喃半乳糖(IPTG)诱导下,表达谷胱甘肽S-转移酶(GST)-NP1蛋白。用亲和层析纯化的融合蛋白免疫大白兔,制备NP1抗血清并用ELISA法测定抗血清效价。采用Western blotting和免疫荧光法检测NP1抗血清的特性。结果:成功构建MVC NP1基因的原核表达质粒pGEX-4T-3-NP1,在大肠杆菌中获得高效表达。表达产物经亲和层析纯化后得到高纯度的NP1融合蛋白,以其免疫大白兔获得NP1多抗血清,ELISA法检测效价达到1∶400 000。Western blotting法及免疫荧光检测,所得抗血清具有较高的效价及特异性。结论:本研究利用原核表达的MVC GST-NP1融合蛋白制备的NP1抗血清效价高、特异性高,为进一步深入研究NP1在MVC感染及致病分子机制中的作用奠定了基础。

两株A型禽流感病毒NP基因的PCR扩增及序列分析

研究选择 AIV NP基因为目的基因 ,设计了一对特异性引物 ,筛选出最佳的 RT-PCR扩增条件 ,特异性地扩增出了两株 A型禽流感病毒的部分 NP基因片段 ,并对其进行了序列分析 ,结果表明 ,两株来源于不同禽类的 AIV的NP基因同源率高达 92 %。AIV

新城疫病毒V4株NP和P基因及其间隔区序列的克隆与分析

采用RT-PCR技术克隆了新城疫病毒(NDV)V4株长约4 200 bp的核苷酸序列,并进行了序列测定与分析。结果表明,该序列中包含有NDV V4株NP基因编码区、NP和P基因间隔区以及P基因的全部核苷酸序列。NDV V4株NP和P基因与其他8个NDV毒株相应部分进行同源性比较,与Quuesland V4株的同源性最高。NDV V4株NP和P基因间隔区序列与其他13株NDV毒株相应部分的比较结果表明,F48E9等强毒株较La sota等弱毒、无毒毒株和试验用V4株在这个区域多了6个碱基,这6个碱基插入的位置在La sota等弱毒、无毒毒株全基因组序列的1647-1648 nt处;参比的14株NDV在这个区域的同源性为63．9％-100％,弱毒株之间的同源性较高,弱毒株与强毒株之间及强毒株之间的同源性差异较大。

一株Class Ⅰ新城疫病毒分离株NP和P蛋白基因分子特征和遗传进化分析

本研究对2009年实验室保存的一株Class Ⅰ新城疫病毒分离株NDV09-056的NP和P基因进行了扩增和序列分析,对其分子特征和遗传进化关系进行了分析。结果表明该分离株NP蛋白基因全长为1746nt,共编码489aa,其N端1～401氨基酸相对比较保守,C端402～479氨基酸变化比较大;同源性分析表明本分离株的NP蛋白基因与Ⅰ类新城疫病毒代表毒株之间核苷酸的同源性为93.5%～98.5%,而与Ⅱ类新城疫病毒代表毒株的同源性较低,介于77.0%～79.2%。P蛋白主要氨基酸突变区集中在57～107aa和135～212aa两个区域,而N端和C端相对保守;同源性分析表明本分离株的P蛋白基因与Ⅰ类新城疫病毒代表毒株之间核苷酸的同源性为90.4%～95.3%,而与Ⅱ类新城疫病毒代表毒株的同源性较低,介于68.3%～72.5%。遗传进化分析表明本分离株与Ⅰ类基因3型新城疫病毒代表株NDV08-004的亲缘关系最近。

RNA干扰对流感病毒NP和PA基因表达及病毒增殖的抑制

目的:应用RNA干扰技术(RNAi)研究针对流感病毒NP或/和PA基因的siRNA抑制NP或/和PA基因的表达及抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖.方法:分别构建针对NP,PA及同时干扰NP和PA的三种siRNA表达质粒pEG-FP/NP,pGenesil/PA和pEGFP/NP+PA,转染MDCK后,H5N1亚型流感病毒感染细胞,荧光显微镜判断转染效率,蛋白质印迹和半定量RT-PCR检测NP及PA蛋白表达及基因转录水平的变化,并在不同时间点检测细胞培养上清中的血凝值(HA),观察siRNA抑制流感病毒增殖的能力.结果:荧光显微镜结果表明,重组质粒转染效率达65.0%.蛋白质印迹结果表明,重组质粒pEGFP/NP和pEGFP/NP+PA均能抑制NP蛋白在MDCK细胞内的表达,两者的抑制率分别为64.5%和69.6%.半定量RT-PCR检测到pEGFP/NP质粒在MDCK细胞内对NP基因的转录抑制率为66.0%;pGenesil/PA质粒对PA基因的转录抑制率为63.0%;pEGFP/NP+PA质粒对NP和PA基因的转录同时抑制率,分别为71.4%和69.3%.而对照质粒pEGFP/HK对NP或/和PA基因的蛋白表达及转录均没有抑制作用.HA结果表明,三种质粒均能抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖,以pEGFP6/NP+PA的作用最为显著,它们抑制流感病毒增殖的能力分别为87.0%,75.0%和96.9%.结论:NP或/和PA基因的siRNA质粒可明显抑制NP或/和PA基因的转录和表达,并有效地抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖.

猪流感H1N1亚型NP基因杆状病毒表达载体构建及其在昆虫细胞中的表达

目的获得研发A型猪流感病毒ELISA检测试剂盒和制备NP蛋白单克隆抗体的抗原物质。方法根据已报道的猪流感病毒H1N1亚型NP基因序列(GenBank登录号:GQ422386)人工合成NP基因,通过XbaⅠ和EcoRⅠ特异性酶切,将NP基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTB,经PCR、酶切、测序鉴定后,获得携带NP基因的重组质粒pFast-BacHTB-NP。该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞,经抗生素、PCR筛选,获得转座的杆粒Bac-mid-NP。在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,再感染细胞,收获目的蛋白。结果通过SDS-PAGE和Westernblotting分析表明该蛋白得到表达,且具有良好的生物活性,大小约为57KD。结论实验结果表明已成功构建了携带NP基因的重组质粒pFastBacHTB-NP和转座的杆粒Bacmid-NP,转染后在sf9昆虫细胞上成功的表达。