PLEKHQ1基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞永生化细胞系的建立

目的:建立PLEKHQ1基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)永生化细胞系,为全面研究PLEKHQ1基因功能提供细胞实验材料。方法:采用慢病毒感染的方法将猿猴病毒40(SV40)大T抗原基因导入已鉴定出基因型的MEF中,建立永生化细胞系;利用聚合酶链反应(PCR)检测SV40大T抗原基因在MEF中的整合情况,利用反转录PCR及凝胶成像的方法观察SV40大T抗原基因在MEF中的表达。结果:SV40大T抗原基因已整合至MEF中,且此类MEF已扩大培养及稳定传代半年之久。结论:成功建立的PLEKHQ1基因敲除MEF永生化细胞系,可为进一步研究PLEKHQ1基因功能提供细胞实验材料。

稳定敲低PLEKHQ1基因细胞株的建立

目的:建立稳定敲低PLEKHQ1基因的RAW和THP-1细胞株。方法:在293TX细胞中进行病毒的包装,用获得的高滴度慢病毒感染RAW和THP-1细胞,通过免疫印迹和荧光显微镜,检测病毒感染后RAW和THP-1细胞PLEKHQ1蛋白表达的变化。结果:PLEKHQ1-lentiviral sh RNA-1质粒在转染后表现出明显的干扰作用,感染后能明显下调RAW和THP-1细胞的PLEKHQ1蛋白表达。结论:稳定敲低PLEKHQ1基因的RAW和THP-1细胞株的建立,可为进一步研究PLEKHQ1在相关疾病中的功能奠定基础。

PLEKHQ1基因敲除小鼠的永生化骨髓来源巨噬细胞系的建立

目的:建立PLEKHQ1基因敲除小鼠的永生化骨髓来源巨噬细胞系,为PLEKHQ1基因功能的研究奠定基础。方法:用慢病毒感染的方法将包装质粒pCDH-SV40/GFP导入野生型和PLEKHQ1基因敲除小鼠的骨髓来源巨噬细胞,建立永生化细胞系;观察永生化细胞的生物学性状,用聚合酶链反应(PCR)检测目的基因的整合,用RT-PCR鉴定目的基因的表达,并对永生化和非永生化骨髓来源巨噬细胞的生长状况进行比较。结果:构建的骨髓来源巨噬细胞系已扩大培养并稳定传代,经鉴定,SV40LT抗原已整合入细胞并稳定表达。结论:通过慢病毒感染细胞的方法成功构建了PLEKHQ1基因敲除小鼠的永生化骨髓来源巨噬细胞系。

巨噬细胞系及PLEKHQ1基因敲除小鼠实验固定夹设计

目的:设计研制巨噬细胞系及PLEKHQ1基因敲除小鼠实验固定夹,为小鼠尾部采血和注射实验提供安全、简易、方便及省时的实验工具。方法:采用50 ml注射器按图纸开槽打孔,制作成巨噬细胞系及PLEKHQ1基因敲除小鼠实验固定夹;使用50 ml塑料试管及合适尺寸的塑料底托,制作成小鼠实验固定夹底座。结果:该小鼠固定夹与目前市场销售的小鼠固定夹相比较,具有制作简单、成本低廉、使用安全及操作简便省时等优点。结论:该小鼠实验固定夹为小鼠进行尾部静脉采血及注射等实验操作提供了安全、便利的实验工具,极大的提高了实验的工作效率。

原核质粒pGEX-4T-2-PLEKHQ1及真核质粒pCMV-Myc-PLEKHQ1的构建与蛋白表达

目的:构建基因PLEKHQ1的原核质粒及真核质粒。方法:全长编码基因PLEKHQ1的聚合酶链反应(PCR)产物经Eco RⅠ和Kpn1双酶切后,分别与双酶切后的载体pGEX-4T-2及载体pCMV-Myc相连,在pGEX-4T-2-PLEKHQ1转化E.coli DH5α提取质粒后,转化E.coli BL21中诱导GST-Q1融合蛋白表达,利用谷胱甘肽琼脂糖4B纯化诱导的融合蛋白;而pCMVMyc-PLEKHQ1则瞬转至293TX细胞;用蛋白质印迹法(Western blot)检测GST-Q1和Myc-Q1融合蛋白表达。结果:将获得的重组质粒进行双酶切鉴定,得到约1500 bp的目的片段,符合预计大小。质粒经测序分析正确后,Western blot检测到诱导及纯化后的GST-Q1和转染293TX后的Myc-Q1蛋白。结论:成功构建的pGEX-4T-2-PLEKHQ1和pCMV-Myc-PLEKHQ1重组质粒,为深入研究PLEKHQ1功能奠定良好的基础。