人巨细胞病毒UL144基因克隆表达及其对树突状细胞功能的影响

目的:构建携带人巨细胞病毒(hCMV)UL144基因的重组腺病毒,研究UL144基因修饰的树突状细胞(dendritic cell,DC)的功能变化。方法:从hCMV-DNA阳性患者外周血提取cDNA,采用PCR技术扩增出UL144基因。采用AdEasy系统构建携带hCMVUL144基因的重组腺病毒载体pAd-UL144,转染HEK293细胞后包装产生重组腺病毒Ad-UL144。通过RT-PCR检测目的基因的表达。将此重组腺病毒转染小鼠骨髓来源的DC,采用流式细胞术检测DC表面分子,采用ELISA技术分析DC培养上清中的细胞因子,采用3H-TdR掺入法检测UL144基因修饰的DC激活T细胞增殖的能力。结果:成功将UL144基因片段克隆至载体上,并经HEK293细胞包装出病毒颗粒,经测定病毒滴度为3×1010pfu/ml。流式细胞术检测显示,UL144基因修饰的DC表面分子CD80、CD86和I-Ad表达水平低于对照组(P<0.01)。ELISA分析表明,UL144基因修饰的DC分泌TNF-α、IL-6和IL-1β的能力减弱(P<0.05)。UL144基因修饰的DC介导的T细胞增殖功能明显低于DC对照组(P<0.01)。结论:UL144基因修饰的DC具有维持相对未成熟状态的能力,并减弱了对抗原特异性T效应细胞的刺激功能。

引起不同临床表现的巨细胞病毒UL144基因多态性的研究

目的研究不同临床背景的人巨细胞病毒（HCMV）临床株中UL144基因的多态性，探讨其多态性与HCMV感染临床表现之间的关系。方法采用巢式PCR法，对具有不同临床表现的122份HCMV感染患儿的尿标本和53份先天性巨结肠患儿痉挛段肠组织标本的临床株进行UL144开放阅读框的扩增，扩增阳性的临床株进行UL144开放阅读框核苷酸测序。结果50份尿标本和23份肠组织标本临床株完成DNA测序。种系进化树分析结果显示HCMVUL144基因分为3组4个基因型，UL144G1a（52％）为主要基因型。有症状与无症状HCMV感染临床株的基因型分布比较，差异无显著性。引起神经系统及肝胆系统受累的临床株与无症状感染临床株基因型分布比较，差异无显著性。与美国及日本的临床株比较，UL144基因型分布差异具有显著性。结论HCMVUL144基因具有高度多态性；UL144G1a为先天性或围生期HCMV感染的主要基因型；UL144基因分布与地理位置有关；UL144基因分型与HCMV感染的临床表现及组织嗜性无关。

人类巨细胞病毒UL144基因在临床低传代分离株中的多态性研究

目的 探讨人类巨细胞病毒 (humancytomegalovirus ,HCMV)UL144序列在临床患儿低传代分离株中的多态性及其与临床疾病的关系。方法 对 6 5株HCMV临床低传代分离株及 7例同年龄组HCMV DNA定量PCR方法检测阳性健康儿尿液进行HCMV UL144PCR扩增分析 ,对HCMV UL144扩增阳性标本进行HMA SSCP分析 ,并对其中 32个阳性标本进行HCMV UL144基因全序列测定及分析。结果 6 5株分离株中有 5 5株UL144全序列引物PCR扩增为阳性 ,7份QPCR检测HCMV DNA阳性健康儿尿液中 5份UL144全序列引物PCR扩增为阳性。 6 0份UL144扩增阳性标本HMA SSCP (heteroduplexmobilityassayandsingle strandedconformationpolymorphism)分析呈现 3种典型带形 ,32个测序标本序列呈现较高的多态性 ,差异多位于序列的前半部 ,种系发生图谱分析可大致分为 3组 ,二级结构预测表现为 6种类型 ,在重要的蛋白质功能区氨基酸序列高度保守。各病种间结果比较显示 ,巨结肠患儿分离株序列没有Ⅱ型 ,小头畸形患儿的序列分布以Ⅰ型为主 ,黄疸患儿以Ⅲ型为主。32个HCMV UL144序列已被GenBank收录。结论 HCMV UL144广泛存在于临床低传代分离株中 ,序列呈现高度多态性 ,不同疾病类型的HCMV UL144序列不同 ,提示UL144基因可能在HCMV致病上起一定的作用。

先天性巨结肠患者人类巨细胞病毒UL144基因多态性的研究

目的研究人类巨细胞病毒(human cytomegalovims,HCMV)UL144基因在先天性巨结肠(Hirschsorung's disease,HD)临床株中的多态性,探讨HCMV UL144基因多态性与致病性之间的关系。方法随机选取53个先天性巨结肠患儿痉挛段结肠手术标本及经荧光定量PCR方法检测HC- MV DNA为阳性的4个HD患儿的尿标本,对照组为无症状或仅有皮肤轻度黄疸的6个尿标本。应用巢式聚合酶链反应的方法,扩增HCMVUL144基因开放阅读框架(ORF),扩增阳性的临床株进行双向 DNA测序,最后通过DNAclub、Bioedit、DNAstar、GeneDoc等软件进行分析。结果23份HD痉挛段肠组织(46％)及4份尿标本HCMVUL144基因扩增阳性,并且完成测序。种系进化树分析结果显示25个 HD患儿的DNA序列分为3个基因型,G1A型64．O％,G2型24％,G3型12％。与对照组比较,经X^2检验,X^2=10．93,p为0．012;其中HD临床株G1A和G3型基因经Fisher检验,P为0．015,差异具有统计学意义。全结肠型、长段型及普通型HD分散分布于UL144各个基因型中。结论HD与HCMV感染有关,HCMV可能是HD的病因之一;在HD患儿中,HCMV感染以UL144．基因G1A型为主;HD的临床分型与HCMVUL144基因分型无关。

引起新生儿晚期黄疸的巨细胞病毒UL144基因多态性研究

【目的】研究引起新生儿晚期黄疸的人巨细胞病毒（cytomega lovirus,HCMV）UL144基因的多态性,探讨HCMV UL144基因多态性与致病性之间的关系。【方法】应用荧光定量PCR法检测本院新生儿科2008年1—12月98例晚期黄疸新生儿样本HCMV-DNA含量,采用巢式聚合酶链反应扩增阳性标本HCMV UL144基因开放读码框（ORF）,结果进行双向DNA测序,通过BioEdit、DNAstar、GeneDoc等软件进行序列分析。【结果】1）30例晚期黄疸新生儿HCMV荧光定量PCR检测阳性,阳性率30.6%,其中2例UL144基因扩增阴性。2）28株UL144基因与Toledo株进行同源性比较,核苷酸水平为80.4%~99.2%,氨基酸水平为78.9%~98.8%。种系进化树分析将DNA序列分为3个基因型,其中G1型7株（25%）,G2型7株（25%）,G3型14株（50%）。3）ExPASy数据库预测分析UL144基因编码产物重要功能区包括2个半胱氨酸富集结构域（CRD1、CRD2）、1个跨膜区和1个胞浆区。G1-G3型蛋白质二级结构高变区主要分布在CRD1区,跨膜区和胞浆区结构高度保守。【结论】1）HCMV感染是导致新生儿晚期黄疸的原因之一;2）HCMV UL144基因编码跨膜区和胞浆区结构高度保守,CRD1呈高度多态性;3）晚期黄疸新生儿中HCMV感染以G3型为主。

人巨细胞病毒UL144基因序列分析及T细胞CTL表位预测

目的了解引起新生儿晚期黄疸的人巨细胞病毒（HCMV）UL144基因多态性,预测UL144基因各型编码蛋白的T细胞CTL表位。方法应用荧光定量PCR法检测晚期黄疸新生儿标本HCMV-DNA含量,采用巢式聚合酶链反应扩增阳性标本HCMV UL144基因开放读码框（ORF）,结果进行双向DNA测序,绘制种系进化树对HCMV感染患儿UL144基因进行分型。应用SYFPEITHI和NetCTL方案预测HCMV UL144基因编码蛋白各临床株T细胞CTL表位。结果①30例晚期黄疸新生儿荧光定量PCR检测阳性,其中28例UL144基因扩增阳性。②28株UL144基因与Toledo株进行同源性比较,核苷酸水平为80.4%~99.2%,氨基酸水平为78.9%~98.8%。种系进化树分析显示感染患儿标本UL144基因可分为3个基因型,G1型7株（25%）,其中G1a3株,G1b3株,G1c1株,G2型7株（25%）,G3型14株（50%）。③初步筛选出UL144基因各型T细胞CTL表位：G1a：YTYFSTPGV或HTYFSTPGV;G1b：HTYFSTPGV;G1c：YTSFSISGV;G2：TLCPNGTYL或TLCPNGTYL和HTLFSTPGV;G3：TLCPNGTYV。结论①HCMV UL144基因的DNA序列具有高度多态性,晚期黄疸新生儿中HCMV感染以G3型为主。②各型编码蛋白的T细胞CTL表位存在差异。

人巨细胞病毒UL144基因序列分析及B细胞表位预测

目的了解引起新生儿晚期黄疸的人巨细胞病毒（HCMV）UL144基因多态性,预测UL144基因各型编码蛋白的B细胞优势表位。方法应用荧光定量PCR法检测晚期黄疸新生儿标本HCMV-DNA含量,采用巢式聚合酶链反应扩增阳性标本HCMV UL144基因开放读码框（ORF）,结果进行双向DNA测序,绘制种系进化树对HCMV感染患儿UL144基因进行分型。结合亲水性参数、可及性参数、抗原性参数、柔韧性参数及二级结构方案对HCMV UL144基因编码各型蛋白的B细胞表位进行预测,参照已建立的预测方法综合评价B细胞优势表位。结果①30例晚期黄疸新生儿荧光定量PCR检测阳性,其中28例UL144基因扩增阳性。②28株UL144基因与Toledo株进行同源性比较,核苷酸水平为80.4%-99.2%,氨基酸水平为78.9%-98.8%。种系进化树分析显示感染患儿标本UL144基因可分为3个基因型,G1型7株（25%）,G2型7株（25%）,G3型14株（50%）。③HCMV UL144基因G1型和G2型B细胞表位均位于编码蛋白N段109-119位,G3型于氨基酸116位缺失一个谷氨酰胺,B细胞表位位于编码蛋白N段109-118位。结论①HCMV UL144基因的DNA序列呈高度多态性,但B细胞表位预测高度保守;②UL144 G3型氨基酸N段116位（Q）位点缺失可能改变该抗原表位的抗原性。

先天性巨结肠患者人类巨细胞病毒UL139基因多态性的研究

目的研究人巨细胞病毒(HCMV)UL139基因在先天性巨结肠(HD)临床株中的多态性,探讨其多态性与HD之间的关系。方法对53株HD患儿痉挛段肠组织标本和6株尿标本的临床株进行UL139开放阅读框(ORF)的扩增及测序。对照组为10个无症状HCMV感染患儿的尿标本。结果28个HD临床株完成测序,进化树分析结果显示UL139基因DNA序列分为3组5个基因型,G3为主要基因型(48.1%)。与对照组比较,χ2=7.378,P=0.194。24个临床株同时完成了HCMVUL144基因测序,HCMVUL144与UL139基因经Kendall等级相关分析τ=-0.114,P=0.425。不同临床分型HD分散分布于UL139各个基因型中。结论HCMVUL139基因具有高度的多态性;UL139基因分型与HD的临床分型无关;UL139基因与UL144基因无相关性。