IDH突变型低级别星形细胞瘤p16蛋白表达与CDKN2A基因缺失状况的相关性

目的:以异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)突变型星形细胞瘤为研究对象,探讨利用p16蛋白免疫标记替代CDKN2A基因纯合性缺失检测的可行性。方法:收集我院既往组织学诊断为低级别星形细胞瘤(WHO 2级)且伴有IDH突变的胶质瘤42例,通过免疫组化方法检测肿瘤组织中p16蛋白表达,分别依据其胞核或胞浆阳性表达率将肿瘤分为阴性(阳性率0%)、低表达(0%<阳性率≤10%)、中表达(10%<阳性率≤25%)、高表达(25%<阳性率≤50%)及过表达(阳性率>50%)5个组别;利用FISH方法检测肿瘤CDKN2A基因纯合性缺失与杂合性缺失状况;采用Fisher精确检验评价p16蛋白表达水平与CDKN2A基因缺失间的相关性。结果:胞核p16蛋白表达水平与CDKN2A基因纯合性缺失间存在显著相关(P<0.001)。阴性组(4/4,100%)均检测到CDKN2A纯合性缺失,中、高及过表达组(22/22,100%)均未检测到CDKN2A纯合性缺失。低表达组与CDKN2A纯合性缺失间缺乏明确对应关系,其中3例(3/16,18.75%)检出纯合性缺失,13例(13/16,81.25%)未检出纯合性缺失。胞核p16蛋白表达水平与CDKN2A杂合性缺失无相关(P=0.228)。胞质p16蛋白表达水平与CDKN2A纯合性(P=0.086)或杂合性(P=0.884)缺失均无相关。结论:IDH突变且组织学呈低级别的星形细胞瘤中,胞核p16蛋白阴性(阳性率0%)或中等及以上表达(阳性率>10%)分别提示存在或不存在CDKN2A纯合性缺失。在上述区间p16蛋白与CDKN2A纯合性缺失间存在良好匹配关系,可用于协助病理诊断与分级。胞核p16蛋白低表达(0%<表达率≤10%)则不能预测CDKN2A纯合性缺失状态,此时仍需进行CDKN2A基因层面检测。

CDKN2/p16基因HapⅡ位点甲基化与肺癌关系的研究

目的:通过检测CDKN2/p16抑癌基因上游调控序列及外显子E1 HapⅡ位点甲基化状态,探讨基因甲基化在肺癌发生中的作用,为肺癌的早期诊断及基因治疗提供可能的理论依据。方法:取58例肺癌患者手术切除的肺癌病理组织标本,16例肺组织良性病变并手术患者的病理标本作为对照。免疫组织化学技术检测p16蛋白表达,甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)技术分析该基因HapⅡ位点甲基化状态。结果:58例肺癌患者中,14例HapⅡ位点发现甲基化,甲基化率为24.14%,而对照组没有发现甲基化。其中,p16蛋白阳性者中2例发现甲基化,甲基化率为7.4%,而p16蛋白阴性者中12例发现甲基化,甲基化率为38.7%,差异有显著性(X^2=7.72,P=0.006)。结论:CDKN2/p16基因外显子E1及调控序列HapⅡ位点异常甲基化,可抑制p16蛋白表达,这可能是p16基因功能丧失的一个重要机制,并可能对肺癌发生起促进作用。

CDKN2/p16基因在四种原发恶性肿瘤中存在状态的研究

目的 :研究CDKN2 /p16基因缺失和蛋白丢失在非小细胞肺癌、食管癌、胃癌、乳腺癌 4种原发恶性肿瘤中的作用。方法 :采用免疫组织化学法和多重PCR技术对 68例 (非小细胞肺癌 3 1例 ,食管癌 15例 ,胃癌 13例 ,乳腺癌 9例 )原发肿瘤组织标本进行CDKN2 /p16基因第一、第二外显子纯合缺失和p16蛋白表达丢失分析研究。结果 :第一或 (和 )第二外显子总缺失率为 13 .2 % ( 9/68) ,蛋白丢失率为 44% ( 3 0 /68) ,不同肿瘤组织标本的p16基因缺失率和蛋白丢失率差别很大。结论 :CDKN2 /p16基因是重要的多肿瘤抑制基因 ,在不同肿瘤组织中其失活方式不完全相同。

p16^INK4a基因及其抑制基因Bmil在不同年龄人角膜内皮细胞中的表达及其意义

背景p16^INK4a基因在细胞老化和早衰过程中发挥着重要作用，是目前已知的细胞衰老的主导基因。角膜内皮细胞（CECs）周期停滞于G。期且体内缺乏增生能力，是否与细胞衰老有关尚未得知。目的探讨不同年龄的正常人CECs中p16^INK4a基因及其抑制基因Bmil的表达。方法收集临床上DX液保存的行角膜移植手术后剩余的供体周边环状角膜组织，记录供体年龄。经锥虫蓝一茜素红双染法观察CECs的活性；行苏木精一伊红染色以证实角膜材料的组织结构正常。将收集到的角膜环材料按照年龄分为〈30岁组、30～50岁组和〉50岁组，每组30个角膜环，其中15个用于总RNA提取，另外15个角膜环等分为3份，分别用于免疫组织化学检测、免疫荧光检测和CECs活性的观察。提取每个角膜环的总RNA，行实时荧光定量PCR检测，观察p16^INK4amRNA、BmilmRNA和Ki67mRNA在CECs中的表达。行冰冻切片免疫组织化学染色，检测p16^INK4a、Bmil和Ki67蛋白在CECs中的表达。免疫荧光法检测p16”“。在CECs的表达。结果苏木精一伊红染色结果显示，供体角膜上皮、基质和内皮结构完整，排列规则。实时荧光定量PCR检测显示随年龄增长，p16^INK4a。mRNA的表达增强，而BmilmRNA和Ki67mRNA的表达减弱，差异均有统计学意义（F=5．703，P=0．014；F=3．950，P=0．042；F=548．500，P=0．000），其中与〈30岁组比较，〉50岁组p16^INK4amRNA在CECs中的表达量明显升高，而BmilmRNA和Ki67mRNA的表达均明显降低，差异均有统计学意义（P=0．006、0．013、0．000）。免疫组织化学结果可见，p16^INK4a。蛋白在各组CECs中均有表达，主要位于细胞核内，而Bmil与Ki67在年老供体的表达强度均弱于年轻供体，与实时荧光定量PCR的结果基本一致。免疫荧光染色显示，年老供体CECs p16^INK4a的表达强度强于年轻供体。结论细胞衰老主导基因p16^INK4a的表达随年龄增加而增高，其抑制基因Bmil的表达随年龄增加而降低。

腺病毒介导的P16/CDKN_2基因对TJ899细胞系活性的影响

目的 研究 5型腺病毒载体 (Ad5)携带P1 6基因对恶性脑胶质瘤细胞系TJ899生长状态的影响。②方法 免疫组化(SP法 )测定P1 6蛋白表达 ,MTT(methlythiazolyltetrazolium ,MTT)法测定恶性脑胶质瘤细胞系生长状态 ,克隆形成实验。③结果 重组体腺病毒能介导P1 6外源基因在恶性脑胶质瘤细胞系TJ899细胞中阳性表达 ,6d时肿瘤细胞生长抑制率为 93 % ,并且能显著地抑制肿瘤细胞的克隆形成能力。④结论 腺病毒介导P1 6基因能在肿瘤细胞中表达 。

良性前列腺增生组织中P16^ink4a与HST2 mRNA表达情况的初步探讨

目的:探讨衰老基因P16ink4a与长寿基因HST2在BPH组织中的表达。方法:对23例BPH及18例正常前列腺标本,提取总RNA后行RT-PCR,并对BPH、正常前列腺组织标本中HST2和P16ink4a基因表达进行定性及半定量分析。结果:正常前列腺组织与增生前列腺组织中均无HST2 mRNA表达,仅检测出P16ink4a mRNA的表达。半定量分析显示P16ink4a mRNA的表达在正常前列腺组织(0.4868±0.0545)明显高于BPH组织(0.2783±0.0268),差异有显著性(P<0.05)。结论:P16ink4a基因在BPH发病中可能有重要意义,可能是导致细胞衰老逃逸的因素之一。

CDKN2(P16)基因的研究现状

早在1992年Skolnick等在人类第九号染色体寻找黑素瘤易感基因时,发现9P21位点频发缺失与突变,后来Kamb及Beach分别领导的两个科研小组通过对多种癌细胞的普查,发现了一个新的能抑制多种肿瘤的基因——P16基因,P16基因,又称MTS1(Multiple Tumor Suppressor 1),或称INK4a(Inhibitor of Cyclin—dependent Kinase 4a)。

非小细胞肺癌pl6/CDKN2基因失活的研究

目的：分析中国人非小细胞肺癌中ｐ１６／ＣＤＫＮ２基因失活的情况，探讨该基因在肺癌发生中的作用。方法：选取与ｐ１６基因紧密连锁的Ｄ９Ｓ１７４８位点，对１７例临床切除的原发性肺癌标本进行微卫星不稳定性分析，用甲基化特异性ＰＣＲ（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ， ＭＳＰ）检测 ｐｌ６基因启动子区 ＣｐＧ岛甲基化状况，用免疫组织化学法检测Ｐ１６蛋白表达情况。结果：微卫星不稳定性分析结果表明，在１３例Ｄ９Ｓ１７４８位点存在多态性的肿瘤ＤＮＡ中有 ９例（６９ ．２％）发生了杂合性缺失（ｌｏｓｓ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ， ＬＯＨ）。 ＭＳＰ的结果显示，有 ７０． ６％（１２／１７）的肿瘤组织存在ｐ１６启动子区的异常高甲基化。在本研究中，８２．４％（１４／１７）的肿瘤组织可以检测出一种或两种ｐ１６基因的异常改变。对此１７例肿瘤标本进行的免疫组织化学分析显示，有 １３例 Ｐ１６蛋白表达阴性，其中 ９２ ３％（１２／１３）存在一种或两种ｐ１６基因的异常改变。免疫组化结果与ｐ１６基因分子遗传学改变情况基本吻合。结论：作为一种抑癌基因，ｐ１６在多种肿瘤组织中都有异常改变。我们的研究表明，ｐ１６基因失表达是非小细胞肺癌?

p16^(INK4)、p21^(ras)及p185^(C-erbB-2)蛋白在子宫内膜癌的表达及临床病理意义

目的:研究p16 INK4 蛋白在子宫内膜增殖症和子宫内膜癌的表达特征,以探讨其与p2 1ras、p185 C erbB 2 蛋白的相互关系及在子宫内膜癌发生发展中的作用。方法:应用免疫组化SP法检测6 5例子宫内膜癌及2 0例子宫内膜增殖症组织中p16 INK4 、p2 1ras及p185 C erbB 2 蛋白的表达。结果:子宫内膜增殖症组织p16 INK4 蛋白表达率为85 .0 0 % (17/ 2 0 ) ,子宫内膜癌组织p16 INK4 蛋白表达率为6 0 .0 0 % (39/ 6 5 ) ,其表达与组织分级及p185 C erbB 2 蛋白表达呈负相关。结论:p16 INK4 蛋白失表达与子宫内膜癌分化差有一定关系,与p2 1ras、p185 C erbB 2 蛋白的联合检测可反映肿瘤的分化。

角质形成细胞增生行为与p16^(INK4a)蛋白表达和基因失活的相关性研究

目的:探讨角质形成细胞(KC)增生行为与p16INK4a蛋白表达及其基因失活的相关性。方法:对20例皮肤鳞状细胞癌、24例基底细胞癌、18例Bowen病、12例光线性角化病以及8例脂溢性角化病共计82例患者中具不同增生行为的KC,分别应用免疫组化检测其p16INK4a蛋白表达;应用聚合酶链反应(PCR)、PCR-单链构象多态性以及PCR-限制性内切酶分析方法分别检测p16INK4a基因外显子1和外显子2的缺失、突变和甲基化。结果:p16INK4a蛋白表达的阳性率和表达强度随着KC恶性程度的增加而降低,基因缺失和甲基化是皮肤癌p16INK4a基因失活的主要方式,p16INK4a蛋白失表达与其基因失活是一致的。结论:p16INK4a基因失活在KC恶性转化中起重要作用;p16INK4a基因有可能成为皮肤癌诊断与治疗的一种新靶位。

小鼠p16^(INK4a)基因位点的结构和功能研究

p1 6INK4a基因的失活与多种肿瘤的发生和发展有联系。通过筛选小鼠基因组文库 ,获得长度为 1 4.5kb的p1 6INK4a基因组DNA片段。对上述 1 4.5kbDNA测序后进行生物信息学分析表明 :该片段包含 3个外显子 ,编码 1个由 1 68个氨基酸残基组成的多肽 ,其相对分子质量的理论计算值为 1 7941 ,有 7个可能的磷酸化位点 ,说明p1 6INK4a蛋白的功能可能受到磷酸化的调控。该DNA片段的非编码区分布着大量短散布元件、长散布元件和简单重复序列 ,这样的结构为转座和同源重组提供了结构基础 ,提示了部分肿瘤细胞中p1 6INK4a基因缺失的可能原因。

p16^(INK4a)基因的功能及其调控

p16 INK4a蛋白能抑制CDK4和CDK6的活性 ,使 pRb处于非磷酸化或低磷酸化状态而能与转录因子E2Fs结合 ,从而抑制DNA的合成 ,阻止细胞由G1期进入S期 .p16 INK 4a的表达受Ets1和Ets2的正调控 ,受Bmi 1的负调控 .p16 INK 4a基因缺失、突变、甲基化、RNA剪接加工错误可导致细胞周期失控和癌变 .应用p16 INK 4a 对某些肿瘤进行基因治疗的研究正在进行中 .

毛冠鹿p16^(INK4)基因第二外显子序列分析

采用PCR扩增技术首次克隆毛冠鹿p16 INK4 基因第二外显子 ,DNA杂交和序列分析发现 ,在 30 7个碱基的第二外显子中仅有 5个碱基的差异 ,同源性达 98.4% .p16 INK4 基因的第二外显子是高度保守的区域 。

小鼠胚胎干细胞p16^(INK4a)基因外显子1α打靶研究

在活体水平上 ,小鼠p16 INK4a基因是否具有抑制肿瘤发生和发展的功能是一个悬而未决的问题。利用筛选基因组文库得到的小鼠p16 INK4a基因组DNA片段 ,构建了针对小鼠p16 INK4a 基因外显子 1α的基因打靶载体 ,其短臂为1.5kbEco81Ⅰ AccⅡ片段 ,长臂为 5 .9kbXbaⅠ XhoⅠ片段。打靶载体经线性化和纯化后通过电穿孔转导小鼠R1ES细胞 ,获得 37个G418和Gancyclovir双药抗性克隆。用Southern杂交法对双药抗性克隆进行鉴定 ,获得一个敲除了p16 INK4a基因外显子 1α的阳性ES细胞克隆。

外源基因转染导致小鼠体细胞过快衰老及p16^(INK4a)表达水平变化

对小鼠胎儿成纤维细胞进行外源基因转染时发现,外源基因转染后的小鼠体细胞染色体端粒的长度以每代47 bp碱基缩短;在转染后的衰老细胞中,或细胞随着增龄,p16INK4 5’-调控区DNA甲基化程度逐渐降低;利用RT-PCR与Northern blot证明,衰老细胞与年轻细胞中的p16INK4a基因的表达水平存在显著差异,传代45代的细胞和外源基因转染后的衰老细胞p16INK4a基因的表达水平大约是原代细胞的12～16倍,而原代细胞与20代细胞间的差异很小。外源基因转染后的衰老细胞核移植后能支持克隆胚胎的体外早期发育。

EB病毒活化端粒酶与p16^(INK4A)/E2F1调控的关系

目的 探讨EB病毒诱导人鼻咽上皮细胞永生化过程中 ,EB病毒活化端粒酶与EB病毒介导的细胞周期紊乱的关系。方法 利用WesternBlotting检测p16 INK4A和E2F1蛋白表达情况 ;利用hTERT -SEAP报道基因和端粒酶PCR -ELISA分别检测hTERT表达和端粒酶活性。结果 EB病毒下调p16 INK4A表达 ,并上调E2F1表达 ;与之相关 ,EB病毒诱导hTERT表达 ,并活化端粒酶活性。