银杏叶提取物对AFB1所致大鼠肝癌基因P16Ink4a mRNA及蛋白表达的影响

目的:动态观察银杏叶提取物(ginkgo biloba extract,EGb761)在抑制黄曲霉毒素B1(AFB1)诱发大鼠肝癌过程中对肝组织相关基因P161nk4a mRNA表达水平的影响,进一步从分子生物学水平揭示银杏叶提取物抗癌的机制及其效果。方法:将70只4周龄Wistar雄性大鼠随机分为3组:AFB1组(25只),AFB1+EGb761组(25只)及对照组(20只)。在诱发肝癌过程中,分别于第13、33及53周对大鼠进行肝组织活检;至第73周处死全部动物取肝组织。应用实时荧光定量PCR和Westernblot技术动态检测肝组织中P16Ink4a mRNA及相应蛋白的表达情况。结果:AFB1组原发性肝癌发生率为58.8%(10/17);AFB1+EGb761组为29.4%(5/17);对照组为0(0/16) AFB1+EGb761组肝癌发生率显著低于AFB1组(P<0.05)。AFB1+EGb761组的肝组织P16Ink4amRNA及相应蛋白表达水平在第53周及第73周时均明显高于AFB1组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:银杏叶提取物(EGb761)具有抑制AFB1致大鼠肝癌的作用。其机制可能与调控肝细胞抑癌基因P16Ink4a

HPV感染病例与P16^(INK4a)表达的关联研究

目的:研究P16^(INK4a)在宫颈炎症与宫颈鳞状上皮内病变以及癌组织中的免疫表达及其与临床病理特征和HPV-DNA分型的相关性。方法:收集商丘市第一人民医院2020年4月至2023年4月404例宫颈病变组织病理活检,包括炎症组织、宫颈鳞状上皮内病变以及鳞状细胞癌(SCC);统计所有病例的P16^(INK4a)免疫组化染色与HPV-DNA分型结果,并分析各病变组织中的P16^(INK4a)与HPV分型关系。结果:P16^(INK4a)的表达在各种宫颈病变组织中存在显著差异(P<0.05),且P16^(INK4a)的阳性率与表达强度随宫颈病变程度的加深而增加;宫颈组织中P16^(INK4a)的表达在低危型与高危型HPV间有显著差异(P<0.05),P16^(INK4a)的表达强度与高危型HPV有相关性(P<0.001)。结论:P16^(INK4a)免疫染色结合HPV-DNA分型能有助于鉴别高级别CIN和宫颈癌,以及区分这些病变与低级别CIN和正常宫颈组织。

食管鳞癌中hMLH1、E-cadherin、p16^INK4a基因启动子甲基化及其意义

背景与目的:目前认为抑癌基因启动子甲基化导致转录抑制是恶性肿瘤发生的重要机制之一,hMLH1、E-cadherin及p16INK4a基因在多种恶性肿瘤中都已被证实存在较高频率的甲基化。本研究通过检测食管鳞癌组织及癌旁组织中hMLH1、E-cadherin、p16INK4a基因启动子甲基化的发生情况,探讨hMLH1、E-cadherin、p16INK4a基因启动子甲基化在食管鳞癌发生发展中的作用。方法:采用酚-氯仿法提取105例食管鳞癌组织及癌旁组织的基因组DNA,应用甲基化特异性PCR对所提DNA进行hMLH1、E-cadherin、p16INK4a基因甲基化检测。采用EnVison免疫组织化学二步法对癌组织中上述3种基因蛋白表达进行检测。结果:癌组织中E-cadherin、hMLH1、p16INK4a基因启动子甲基化的阳性率分别为57.1%(60/105)、20.9%(22/105)和50.5%(53/105),而癌旁食管组织中相应的3个基因的甲基化率分别为10.5%(11/105)、1.9%(2/105)和7.6%(8/105),均显著低于癌组织。E-cadherin(P=0.021)及p16INK4a(P=0.026)基因甲基化与蛋白表达缺失密切相关,而hMLH1基因甲基化与蛋白表达无显著相关性。E-cadherin基因启动子甲基化与淋巴结转移有关(P=0.016),p16INK4a基因启动子甲基化与低分化癌有关性(P=0.024)。hMLH1基因甲基化与各项临床病理特征均无关。结论:食管鳞癌中p16INK4a基因启动子甲基化与相应蛋白表达缺失密切相关,且在低分化癌中更多见;E-cadherin基因启动子甲基化与相应蛋白质表达缺失有相关性,并且有淋巴结转移多见的显著特征,这2个基因的甲基化位点与食管鳞癌密切相关。hMLH1基因甲基化可能并不直接参与食管鳞癌的发生、发展。

结直肠癌患者粪便p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因甲基化状态观察

目的观察结直肠癌(CRC)患者粪便p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因甲基化状态。方法 CRC患者50例(肿瘤组)、结直肠良性病变者50例(良性组)、健康体检者50例(正常组),采用甲基化特异度PCR的方法检测各组粪便p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因甲基化检出率,并分析其与CRC临床病理参数的关系。根据肠镜病理诊断结果进行验证,比较粪便p16INK4a、MGMT、RASSF1A单独及联合检测诊断CRC的敏感度和特异度。结果肿瘤组、良性组、正常组粪便p16INK4a基因甲基化检出率分别为74%、28%、14%,MGMT基因甲基化检出率分别为56%、24%、12%,RASSF1A基因甲基化检出率分别为72%、20%、10%,肿瘤组分别与正常组、良性组比较,P均<0.05。p16INK4a基因甲基化状态与CRC分化程度、TNM分期、淋巴结转移相关,MGMT基因甲基化状态与CRC淋巴结转移相关,RASSF1A基因甲基化状态与CRC分化程度、TNM分期、淋巴结转移相关,P均<0.05。三者联合检测诊断CRC的敏感度为95.8%,特异度为83.4%,ROC曲线下面积为0.816(95%CI 0.739%~0.894%)。结论 CRC患者粪便p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因甲基化检出率明显高于结直肠良性病变者及健康体检者,联合检测上述指标有助于CRC患者的早期诊断及其生物学行为的判断。

胃癌中p16^(INK4a)和RB基因甲基化状况及其表达

目的 :研究胃癌组织中 p16 INK4a和视网膜母细胞瘤易感基因 (RB)启动子区域的甲基化状况 ,并探讨基因异常甲基化与蛋白表达及其临床病理指标的关系。方法 :采用甲基化特异性PCR方法对 81例胃癌和 10例正常胃黏膜中 p16 INK4a和RB启动子区域甲基化状况进行检测 ,并采用免疫组织化学方法对 p16 INK4a和视网膜母细胞瘤蛋白 (pRb)表达情况进行相应检测。 结果 :胃癌中 p16 INK4a和RB基因的甲基化率分别为 37% (30 / 81)和 4 2 % (34/81) ;胃癌p16 INK4a蛋白和pRb表达阳性率分别为 5 4 % (4 4 / 81)和 90 % (73/ 81)。 10例正常胃黏膜中均未检测到p16 INK4a和RB异常甲基化 ,而且其相应蛋白表达均为阳性。 p16 INK4a甲基化状况与其蛋白表达有相关性 ,但p16 INK4a甲基化状态与肿瘤分化程度、淋巴结转移、性别及年龄均不相关。RB甲基化状态与pRb表达、肿瘤分化程度、性别及年龄无相关性 ,但与淋巴结转移相关。结论 :p16 INK4a和RB异常甲基化是胃癌细胞常见的分子事件 ,可能参与了胃癌的发生发展过程。RB异常甲基化与胃癌淋巴结转移相关 ,提示RB甲基化检测对于分析胃癌淋巴结转移情况可能有一定参考价值。p16 INK4a基因启动子区域高甲基化是其蛋白表达抑制的重要机制。

肺癌p14ARF和p16INK4a基因协同表达缺失及其意义

目的 :研究抑癌基因位点INK4a ARF在肺肿瘤细胞中的表达状况 ,揭示p14ARF和p16INK4a协同表达缺失与肺癌发生发展的相关性。方法 :用RT PCR和Westernblot对 6株肺癌细胞 (SPC A 1,Calu 1,H44 6 ,SH77,A5 49,H46 0 )的INK4a ARF基因位点在mRNA、蛋白质水平上进行检测 ,对PCR产物进行纯化和测序分析。结果 :6株肺癌细胞中 ,有 3株细胞 (H46 0 ,Calu 1,A5 49)的p16INK4a基因表达缺失 ,其中 ,Calu 1表达正常p14ARF的mRNA ,而在H46 0和H5 49这两株非小细胞肺癌中 ,p14ARF和p16INK4a发生协同表达缺失。结论 :p14ARF基因与p16INK4a一样 ,是肺肿瘤细胞中的失活靶点之一。揭示了p14ARF缺失导致p5

粪便中MGMT,p16^(INK4A)及ECAD基因启动子甲基化检测在结直肠癌诊断中的价值

目的探讨粪便中p16INK4A、ECAD及MGMT基因启动子甲基化在结直肠癌诊断中的应用价值。方法选择我院老年病科2014年2月至2015年11月收治的65岁以上老年健康者50例(对照组)、结直肠镜检查证实良性结直肠疾病者41例(良性肠病组)和结直肠癌患者46例(肠癌组)为研究对象。采用表观遗传学方法应用甲基化特异PCR对上述患者粪便中p16INK4A、MGMT和ECAD基因启动子DNA甲基化进行检测,判断上述标本中各基因启动子的甲基化水平。根据p16INK4A、MGMT和ECAD基因启动子DNA甲基化水平,评价其作为诊断结直肠癌的敏感性和特异性。结果对照组、良性肠病组和肠癌组p16INK4A基因启动子DNA甲基化率分别为14.0%、24.4%和71.7%;MGM基因甲基化率分别为16.0%、14.6%和54.3%;ECAD基因甲基化率分别为12.0%、19.5%和65.2%。上述基因启动子甲基化率在肠癌组明显高于对照组和良性肠病组,差异均有统计学意义(P<0.05);p16INK4A、MGMT和ECAD诊断肠癌的敏感性分别为0.72、0.54和0.65,特异性分别为0.76、0.75和0.80。结论 p16INK4A、MGMT和ECAD基因启动子甲基化发生率在肠癌患者粪便中显著增高,可作为肠癌诊断的分子标志物。

河南食管癌高发区居民食管癌组织p15INK4b和p16INK4a基因变化的研究

基因丢失导致ｐ１６ＩＮＫ４ａ和（或）ｐ１５ＩＮＫ４ｂ对ＣＤＫ激酶的抑制作用丧失，从而导致细胞增生调节失控［１－３］，目前在多种肿瘤中已发现存在ｐ１５ＩＮＫ４ｂ和ｐ１６ＩＮＫ４ａ的失活现象［４－６］．作者近年对河南食管癌高发区林州市居民的研究证实，肿瘤...

角质形成细胞增生行为与p16^(INK4a)蛋白表达和基因失活的相关性研究

目的:探讨角质形成细胞(KC)增生行为与p16INK4a蛋白表达及其基因失活的相关性。方法:对20例皮肤鳞状细胞癌、24例基底细胞癌、18例Bowen病、12例光线性角化病以及8例脂溢性角化病共计82例患者中具不同增生行为的KC,分别应用免疫组化检测其p16INK4a蛋白表达;应用聚合酶链反应(PCR)、PCR-单链构象多态性以及PCR-限制性内切酶分析方法分别检测p16INK4a基因外显子1和外显子2的缺失、突变和甲基化。结果:p16INK4a蛋白表达的阳性率和表达强度随着KC恶性程度的增加而降低,基因缺失和甲基化是皮肤癌p16INK4a基因失活的主要方式,p16INK4a蛋白失表达与其基因失活是一致的。结论:p16INK4a基因失活在KC恶性转化中起重要作用;p16INK4a基因有可能成为皮肤癌诊断与治疗的一种新靶位。

P14^(ARF)、P16^(INK4a)基因表达与高危型HPV感染的关系

目的探讨P14ARF、P16INK4a的基因表达与高危型人乳头瘤病毒DNA(HPV DNA)感染的关系。方法采用免疫组化EnVision法,对130例宫颈鳞癌、宫颈上皮内瘤变60例、20例正常宫颈组织进行P16INK4a、P14ARF蛋白基因检测,并采用原位杂交法检测130例宫颈鳞癌、宫颈上皮内瘤变60例、20例正常宫颈组织中的HPV DNA。结果宫颈鳞癌组中P16INK4a、P14ARF蛋白表达率分别为100.0%(130/130)和96.9%(126/130);在60例宫颈上皮内瘤变组中其表达率分别为85.0%(51/60)、81.7%(49/60);在20例正常宫颈组中其表达率分别为10.0%(2/20)、15.0%(3/20),宫颈鳞癌组显著高于正常对照组(P<0.01);正常宫颈组与宫颈上皮内瘤变及宫颈鳞癌组P16INK4a和P14ARF的表达呈显著差异(P<0.05)。HPV16/18在130例宫颈鳞癌中86例(66.2%)表达阳性;在宫颈上皮内瘤变中39例(65.0%)表达阳性;P16INK4a、P14ARF阳性率HPV DNA阳性宫颈鳞癌、宫颈上皮内瘤变组与HPV DNA阴性宫颈鳞癌、宫颈上皮内瘤变组比较无显著差异(P>0.05)。结论P16INK4a、P14ARF蛋白在宫颈上皮内瘤变及宫颈鳞癌组织中呈高表达,有较高的特异性和敏感性,可作为宫颈癌前病变及宫颈癌的诊断指标。

p16^(INK4a)基因的功能及其调控

p16 INK4a蛋白能抑制CDK4和CDK6的活性 ,使 pRb处于非磷酸化或低磷酸化状态而能与转录因子E2Fs结合 ,从而抑制DNA的合成 ,阻止细胞由G1期进入S期 .p16 INK 4a的表达受Ets1和Ets2的正调控 ,受Bmi 1的负调控 .p16 INK 4a基因缺失、突变、甲基化、RNA剪接加工错误可导致细胞周期失控和癌变 .应用p16 INK 4a 对某些肿瘤进行基因治疗的研究正在进行中 .

小鼠p16^(INK4a)基因位点的结构和功能研究

p1 6INK4a基因的失活与多种肿瘤的发生和发展有联系。通过筛选小鼠基因组文库 ,获得长度为 1 4.5kb的p1 6INK4a基因组DNA片段。对上述 1 4.5kbDNA测序后进行生物信息学分析表明 :该片段包含 3个外显子 ,编码 1个由 1 68个氨基酸残基组成的多肽 ,其相对分子质量的理论计算值为 1 7941 ,有 7个可能的磷酸化位点 ,说明p1 6INK4a蛋白的功能可能受到磷酸化的调控。该DNA片段的非编码区分布着大量短散布元件、长散布元件和简单重复序列 ,这样的结构为转座和同源重组提供了结构基础 ,提示了部分肿瘤细胞中p1 6INK4a基因缺失的可能原因。

P14^(ARF)和P16^(INK4a)基因在鼻咽癌组织中异常甲基化及其临床意义

目的:通过检测P14ARF和P16INK4a基因启动子区甲基化情况,分析探讨其在鼻咽癌临床诊断和治疗中的意义。方法:运用甲基化特异性PCR对54例鼻咽癌组织和20例正常鼻咽上皮组织的P14ARF和P16INK4a基因启动子区甲基化状态进行检测。结果:鼻咽癌组织中P14ARF和P16INK4a基因启动子区甲基化阳性率分别为20.4%(11/54)和46.3%(25/54),二者总检出率为48.2%(26/54),26例甲基化的癌组织同时出现二者甲基化为10例;而在正常鼻咽上皮组织中未检测到P14ARF和P16INK4a基因启动子区甲基化。结论:鼻咽癌P14ARF和P16INK4a基因启动子区甲基化与患者临床病理特征无明显相关性,为早期事件,有望成为早期分子生物学诊断的标志物,将来还可能作为去甲基化基因治疗的靶点。二者在鼻咽癌发生发展中可能存在协同作用。

p16^(INK4a)/p14^(ARF)基因在细胞衰老和肿瘤抑制中的作用研究进展

细胞衰老发生后细胞在形态和生化成分都发生改变,进而发生生理性功能障碍,最终进入凋亡和死亡程序。细胞衰老是生命体在细胞水平防止永生化和恶变、预防肿瘤发生的一种机制。细胞衰老由多种原因引起,近年来的研究发现,p16INK4a-pRb(视网膜母细胞瘤抗癌蛋白)和p14ARF-p53这2条途径的活化与细胞衰老的启动和调节过程密切相关,对细胞衰老的信号传导通路及其调节因子等方面的深入研究,可以进一步认识细胞增生、衰老进程,以及防治肿瘤的规律,并为衰老相关疾病的治疗提示研究方向。

毛冠鹿p16^(INK4)基因第二外显子序列分析

采用PCR扩增技术首次克隆毛冠鹿p16 INK4 基因第二外显子 ,DNA杂交和序列分析发现 ,在 30 7个碱基的第二外显子中仅有 5个碱基的差异 ,同源性达 98.4% .p16 INK4 基因的第二外显子是高度保守的区域 。

p16^(INK4a)基因在CLD新生鼠肺成纤维细胞中的动态表达

目的探讨p16INK4a基因在高氧致慢性肺疾病(CLD)新生鼠肺成纤维细胞中的动态表达。方法足月新生SD大鼠于生后12h内分别持续吸入0.85高氧和空气,于3,7,14,21d随机处死动物后,进行肺成纤维细胞的原代培养,应用流式细胞仪测细胞周期;免疫组化、Western blot法检测p16INK4a蛋白表达;real-time PCR法检测p16INK4a mRNA含量变化。结果生后3d时2组p16INK4a蛋白及mRNA的表达无明显差异(P>0.05),生后7d时高氧组表达开始减少(P<0.05),14d、21d明显减少(P<0.01)。结论高氧可下调肺成纤维细胞p16INK4a基因的表达,使得其抑制细胞增殖的作用减弱,肺成纤维细胞过度增殖,最终导致肺纤维化的发生。

小鼠胚胎干细胞p16^(INK4a)基因外显子1α打靶研究

在活体水平上 ,小鼠p16 INK4a基因是否具有抑制肿瘤发生和发展的功能是一个悬而未决的问题。利用筛选基因组文库得到的小鼠p16 INK4a基因组DNA片段 ,构建了针对小鼠p16 INK4a 基因外显子 1α的基因打靶载体 ,其短臂为1.5kbEco81Ⅰ AccⅡ片段 ,长臂为 5 .9kbXbaⅠ XhoⅠ片段。打靶载体经线性化和纯化后通过电穿孔转导小鼠R1ES细胞 ,获得 37个G418和Gancyclovir双药抗性克隆。用Southern杂交法对双药抗性克隆进行鉴定 ,获得一个敲除了p16 INK4a基因外显子 1α的阳性ES细胞克隆。

外源基因转染导致小鼠体细胞过快衰老及p16^(INK4a)表达水平变化

对小鼠胎儿成纤维细胞进行外源基因转染时发现,外源基因转染后的小鼠体细胞染色体端粒的长度以每代47 bp碱基缩短;在转染后的衰老细胞中,或细胞随着增龄,p16INK4 5’-调控区DNA甲基化程度逐渐降低;利用RT-PCR与Northern blot证明,衰老细胞与年轻细胞中的p16INK4a基因的表达水平存在显著差异,传代45代的细胞和外源基因转染后的衰老细胞p16INK4a基因的表达水平大约是原代细胞的12～16倍,而原代细胞与20代细胞间的差异很小。外源基因转染后的衰老细胞核移植后能支持克隆胚胎的体外早期发育。

多发性骨髓瘤中p15^(INK4B)和p16^(INK4A)基因高甲基化的检测

为探索p15 INK4B和p16INK4A基因在多发性骨髓瘤中的甲基化的表达 ,采用敏感的甲基化特异的MSP PCR测定方法 ,检测了 2 4例多发性骨髓瘤 (MM ) p15 INK4B和p16INK4A基因甲基化的情况。结果显示 ,MM中 p15 INK4B和 p16INK4A基因甲基化发生率分别为 70 .8% (17/ 2 4 )和 5 8.3% (14/2 4 ) ,产物分别为 148bp和 15 0bp的片段 ,其中 2例Ⅱ期和 2例Ⅲ期的有浆细胞瘤的MM患者发生 2个基因同时甲基化 ,有 5例 2个基因都没有发生甲基化。这 5例的瘤细胞均为分化较成熟的小浆细胞。结论提示 ,p15 INK4B和 p16INK4A基因甲基化在MM细胞中有一定的发生率 。

肿瘤抑制基因p16^(INK4A)在小鼠早孕子宫内膜中的表达

目的:初步探讨p16INK4A在胚胎着床过程中的作用。方法:采用实时FQ-PCR和免疫组织化学技术分别检测未孕(d0)及孕d2、d3、d4、d5、d6、d7小鼠子宫内膜p16INK4AmRNA及其蛋白的表达。结果:实时FQ-PCR显示妊娠子宫内膜组织p16INK4A的mRNA表达高于未妊娠的子宫内膜组织,且随着妊娠天数的增加呈现逐渐增强的趋势,到孕d5达到最高。免疫组化显示p16INK4A蛋白在子宫内膜的表达及规律与实时FQ-PCR的结果一致。结论:小鼠胚胎着床过程中p16INK4A诱导的小鼠子宫内膜上皮细胞的凋亡可能是胚胎着床的重要机制之一。