蜕膜自然杀伤细胞在人早孕期基蜕膜和壁蜕膜的分布比较

目的对比蜕膜自然杀伤(decidual natural killer,dNK)细胞在人早孕期同一个体基蜕膜和壁蜕膜中的分布,探讨其在早孕期的可能作用。方法采用HE染色和免疫组织化学方法标记细胞角蛋白7阳性细胞以区分壁蜕膜和基蜕膜,进而检测CD56的表达,从而显示壁蜕膜和基蜕膜中dNK细胞的数量。结果基质中有细胞角蛋白7阳性的绒毛外滋养层细胞的是基蜕膜标记;CD56呈阳性反应的dNK细胞在基蜕膜中的数量明显多于(P<0.01)壁蜕膜。结论蜕膜自然杀伤细胞在人正常早孕蜕膜中的分布不同,其可能与滋养层细胞的侵入有关。

低氧对胎盘基蜕膜间充质干细胞增殖、凋亡和血管内皮细胞生长因子表达的影响

本文旨在探讨生理低氧和无血清培养条件下人胎盘基蜕膜间充质干细胞(placental decidua basalis-mesenchymal stem cells,PDB-MSCs)的生物学特征和细胞因子的表达情况。采用密度梯度离心法培养获得PDB-MSCs,利用MTT法、流式细胞术检测PDB-MSCs在不同氧浓度(20%O2和1%O2)、有无血清(10%FBS和0%FBS)条件下各个时间点(6h、12h、24h、48h、72h、96h)的增殖和凋亡情况,并采用酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测无血清条件下各个时间点细胞上清液中血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)含量。结果显示,在特定的时间内低氧可以促进PDB-MSCs增殖(P<0.01,n=3),而血清对PDB-MSCs增殖的影响与氧浓度关系密切;同时,在本实验条件下,低氧、无血清分别或联合培养不会导致PDB-MSCs凋亡(P>0.05,n=3);在无血清条件下,24h时低氧组PDB-MSCs表达较高水平的VEGF。以上结果提示,PDB-MSCs可能成为缺血相关组织工程产品种子细胞的一个新来源。

孕激素及胰岛素样生长因子对体外培养的人早孕蜕膜基质细胞增殖活性的影响

目的探讨孕激素及胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ、Ⅱ)对体外培养的人早孕蜕膜基质细胞增殖活性的影响。方法采用3H-TdR掺入法检测孕激素及IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ对体外培养的人早孕5～7周蜕膜基质细胞增殖活性的影响。结果孕激素、IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ对人早孕5～7周蜕膜基质细胞有明显的促增殖作用,可增加细胞增殖1.6～3.4倍(P均<0.01),且具有时间依赖性(P均<0.01)。结论孕激素及IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ可能通过调节人早孕蜕膜基质细胞的增殖和蜕膜化,对胚胎着床及早期妊娠的维持起重要作用。

小鼠子宫蜕膜基质细胞的分离培养

目的：蜕膜组织的细胞成分相当复杂，其中蜕膜基质细胞约占全部蜕膜细胞数的75％，其能分泌多种细胞因子，既参与蜕膜营养供应作用又能调节蜕膜局部的免疫微环境。实验拟建立良好的小鼠子宫蜕膜基质细胞培养方法，为进一步建立蜕膜细胞共培养系统将为研究病理性妊娠打下良好的基础。方法：实验于2006—09／2008-01在泰山医学院实验动物中心，SPF级实验室完成。①实验材料：8～10周龄C57BL／6雌性小鼠，由北京维通力化实验动物技术有限公司提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：选用孕龄6～8d的C57BL／6小鼠蜕膜组织进行体外培养，采用胰蛋白酶、胶原酶、透明质酸酶混合消化，进行全组分蜕膜细胞培养，采用原代细胞过夜换液方法清除红细胞、淋巴细胞和不贴壁的细胞成分，利用传3代方法对蜕膜基质细胞进行分离提纯。纯化后，观察蜕膜基质细胞的生长变化规律，制作细胞爬片，用催乳素免疫组织化学试剂盒检测培养细胞的成分。结果：①小鼠蜕膜基质细胞在接种24h后大部分已贴壁，贴壁生长的细胞成纤维母细胞状，一般培养5～7d后细胞融合成单层。原代培养的蜕膜基质细胞在含10％胎牛血清的培养液中可增生数周，四五天传代1次，传代后的细胞形态无明显变化，而传代培养极性渐不明显。②免疫组织化学显示，体外培养传代后95％阳性细胞为蜕膜基质细胞，细胞大小形状基本均一，染色特点为胞质内可见细小的棕色颗粒，且越近胞核染色越深。结论：采用复合酶消化，换液传代方法提纯蜕膜组织，方法简单、经济实用，并可获得较高纯度的蜕膜基质细胞。

补肾益气方对人蜕膜基质细胞活性及分泌功能的影响

目的观察补肾益气方对人早孕蜕膜基质细胞活性及其分泌白细胞介素10(IL-10)、干扰素γ(IFN-γ)及泌乳素(PRL)的影响。方法收集孕6～10周行人工流产的正常妊娠妇女蜕膜组织,体外分离、培养蜕膜基质细胞,分别以10%,20%补肾益气方含药血清处理细胞24 h、36 h、48 h,同时设立相应培养时间相同浓度的血清对照组,未添加血清组为空白对照组。MTT法检测补肾益气方对蜕膜基质细胞活性的影响。ELISA法检测细胞培养上清中IL-10、IFN-γ,化学发光法检测PRL分泌,流式细胞术检测IL-10R表达。结果 36 h起,20%中药组蜕膜基质细胞活性高于20%血清对照组(P<0.05),48 h时10%,20%中药组细胞活性均高于相应血清对照组(P均<0.05)。24 h起,10%,20%中药组分泌IL-10高于各对照组(P均<0.01);48 h时,20%中药组IL-10浓度高于10%中药组(P<0.05)并且中药组IL-10R表达高于各对照组(P<0.01),20%含药血清组IL-10R表达又高于10%含药血清组(P<0.05)。48 h之内,中药组IFN-γ水平与血清对照组相近(P>0.05)。24 h起,10%,20%中药组分泌的PRL高于各对照组(P均<0.01),并且20%中药组PRL水平高于10%中药组(P<0.01);48 h时2中药组之间PRL水平无显著性差异(P>0.05)。结论补肾益气方可能通过促进IL-10、PRL的分泌,上调IL-10受体表达,调控蜕膜基质细胞生长,达到保胎的目的。

胰岛素样生长因子系统在人早孕蜕膜基质细胞中的基因表达

为探讨胰岛素样生长因子系统 (IGFs)在体外培养的人早孕蜕膜基质细胞中的基因表达及其作用 ,采用逆转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR)技术半定量检测体外培养的人早孕蜕膜基质细胞中 IGFs m RNA表达水平。结果显示 ,体外培养的人早孕蜕膜基质细胞中可以检测出胰岛素样生长因子 - II(IGF- II) m RNA、胰岛素样生长因子 - I受体 (IGF- IR) m RNA、胰岛素样生长因子结合蛋白 - 3(IGFBP- 3) m RNA表达 ,其中 IGF- II m RNA、IGF-IR m RNA表达为强阳性 ,IGFBP- 3m RNA表达较弱。因此认为 ,IGFs可能在早期妊娠蜕膜和绒毛滋养层发育分化、胎盘形成和胚胎生长发育过程中以自分泌和 (或 )旁分泌方式发挥重要的调节作用。

IL-10、IFN-γ调控早孕蜕膜基质细胞活性IL-10受体表达

研究IL-10、IFN-γ对人早孕蜕膜基质细胞活性及IL-10受体表达的影响。MTT法检测蜕膜基质细胞活性,选择两种不同作用浓度的IL-10、IFN-γ作用蜕膜基质细胞,处理15min、30min、45min、60min分别检测组胞IL-10受体R1、R2基因表达。高浓度IL-10(10-100ng/ml)促进蜕膜基质细胞活性(P＜0．05),低浓度IL-10(0．10-lng/ml)则无明显促进作用(P＞0．05)；高浓度IFN-γ(1000ng/ml)抑制蜕膜基质细胞活性(P＜0．01),低浓度IFN-γ(10ng/ml)反而起促进作用(P＜0．05)。较高浓度IL-10(10ng/ml)作用15min即见IL-10R1高表达,30min明显减弱,45min表达消失；较低浓度IL-10(lng/ml)作用60min内未见IL-10R1表达。IFN-γ(100ng/ml)作用45min见IL-10R1短暂低表达：较低浓度IFN-γ(10ng/ml)作用30min诱导IL-10R1中表达,45min表达减弱,60min消失。上述细胞因子作用前后IL-10R2表达差异无显著性(P＞0．05)。因此,我们认为,早孕IL-10、IFN-γ可能通过影响蜕膜基质细胞IL-10R1表达及细胞活性,发挥免疫调节作用。

蜕膜基质细胞培养液对滋养细胞增殖、凋亡及浸润的影响及对浸润作用机制的研究

目的:探讨早孕蜕膜基质细胞培养液(DSCM)对滋养细胞增殖、凋亡以及浸润能力的影响及对浸润功能的作用机制。方法:原代分离、培养并鉴定人早孕蜕膜基质细胞,收集并制备成不同浓度的DSCM,采用噻唑兰(MTT)、Annexin V-FITC、Transwell方法检测不同浓度的DSCM对滋养细胞增殖、凋亡、浸润能力的影响,采用RT-PCR及明胶酶谱法检测滋养细胞基质金属蛋白酶(MMPs)的改变。结果:得到纯度大于90%的蜕膜基质细胞。随着DSCM的浓度增高(5%DSCM,20%DSCM,50%DSCM,100%DSCM)细胞的吸光度值增高、凋亡率减少、浸润细胞数增多(P<0.05)。不同浓度的DSCM组MMP-2及MMP-9 mRNA、蛋白的变化与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:早孕DSCM可以促进滋养细胞增殖,抑制凋亡,并通过上调滋养细胞对MMP-2与MMP-9的表达来促进其浸润功能。

孕激素对人早孕蜕膜基质细胞IGF-Ⅱ基因表达的影响

目的观察孕激素对体外培养的人早孕蜕膜基质细胞中胰岛素样生长因子(IGF)-Ⅱ基因表达的影响。方法采用RT-PCR技术半定量检测不同浓度孕激素(0、0.05、0.1、0.2μmol/L)作用72 h后人早孕蜕膜基质细胞中IGF-ⅡmRNA的表达。结果孕激素上调IGF-ⅡmRNA的表达,并与浓度呈显著正相关(r=0.500,P<0.01)。结论孕激素可能通过上调人早孕蜕膜中IGF-ⅡmRNA的表达,增强IGF-Ⅱ的自分泌/旁分泌作用,这可能是早孕期胎—母组织生长和分化的重要调控机制之一。

孕激素对早孕蜕膜基质细胞胰岛素样生长因子-Ⅰ受体基因表达的调控

目的 探讨孕激素对体外培养的人早孕蜕膜基质细胞胰岛素样生长因子 - 受体 (IGF- R)基因表达的影响。方法 采用逆转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR)技术半定量检测不同浓度孕激素作用 72小时后及 0 .1μm ol/ L孕激素作用不同时间后人早孕蜕膜基质细胞中 IGF- R m RNA的表达水平。结果 体外培养的人早孕蜕膜基质细胞中 IGF- R m RNA呈强阳性表达 ,孕激素降调 IGF- R m RNA的表达 ,并与浓度呈显著负相关 (r=- 0 .6 80 ,P<0 .0 0 1)。孕激素终浓度为 0 .1μm ol/ L时 ,IGF- R m RNA的表达与作用时间无显著相关性 (r=0 .0 0 5 ,P>0 .0 5 )。结论 孕激素可能通过降调人早孕蜕膜基质细胞中 IGF- R m RNA的表达 ,调节基质细胞的增殖和蜕膜化 。

吗啡对体外培养人早孕蜕膜基质细胞MORmRNA表达的影响

我国女性吸毒者数量上升,一些省区,女性吸毒所占比例达40%。女性吸毒,尤其是孕期吸毒,可对受精卵、胚胎、胎儿、新生儿及乳儿的健康产生严重影响。本实验以体外培养人早孕蜕膜基质细胞为实验对象,探讨阿片类药物吗啡直接作用于蜕膜基质细胞引起μ阿片受体（MOR）表达的影响,

孕酮对蜕膜基质细胞体外增殖、凋亡影响

目的：探究孕激素对人蜕膜基质细胞体外增殖、凋亡的影响。方法：原代培养蜕膜细胞,采用四甲基偶氮咗蓝（MTT）比色法及流式细胞仪检测孕酮对细胞增殖、凋亡的影响。结果：20~80μmol/L孕酮可抑制蜕膜细胞的增殖活力（P〈0.05）,可引起蜕膜细胞形态变化。10~80μmol/L孕酮可提高蜕膜细胞总凋亡率（P〈0.05）,但其总凋亡率仍低于6%。结论：孕酮可以抑制人早孕子宫蜕膜细胞的增殖,作用48 h时抑制率与孕酮浓度正相关;孕酮可诱导蜕膜细胞凋亡。

人类蜕膜基质细胞的体外培养

目的 建立良好的人类蜕膜细胞培养方法。方法 选用早孕人工流产蜕膜组织进行体外培养 ,采用胰蛋白酶和EDTA消化 ,进行全组分蜕膜细胞培养 ,利用传 3代的方法对蜕膜基质细胞进行分离提纯。制作细胞爬片 ,用泌乳素 (prolactin ,PRL)免疫组化试剂盒检测培养细胞成分。结果 免疫组化显示体外培养传代后 97%蜕膜细胞为蜕膜基质细胞。结论 实验方法经济实用、简单 ,简化了蜕膜细胞的提纯程序 ,获得的蜕膜基质细胞纯度高。

环孢素A对体外培养的正常人孕早期蜕膜基质细胞γ-干扰素/白介素10分泌的影响

目的 探讨CsA作为免疫抑制剂能否对子宫蜕膜分泌的IFN -γ(Th1) /IL - 10 (Th2 )产生良性调节作用。方法 采用酶消化法对早孕蜕膜基质细胞进行培养 ,并加入含不同浓度的CsA培养基 (0 ,0 .1,1.0 ,10 .0 μmol/l)。分别使用免疫组化和RT -PCR法检测各组细胞IL - 10和IFN -γ在蛋白质和基因水平的表达。结果 CsA在 0 .1及 1.0 μmol/l的浓度可抑制IFN -γ的蛋白质及基因水平表达 (P <0 .0 5 ) ,且IL - 10 /IFN -γ比值增加 (P <0 .0 5 )。当浓度达 10 μmol/l时 ,不表现这种作用 (P >0 .0 5 )。任何浓度的CsA对IL - 10的蛋白质及基因表达均无影响 (P >0 .0 5 )。结论 适宜浓度的CsA可抑制蜕膜IFN -γ(Th1型细胞因子 )的分泌 ,从而间接增加了IL - 10 (Th2型细胞因子 )的分泌 ,使Th1/Th2细胞因子平衡向有利于妊娠的Th2类发展。

小鼠子宫蜕膜基质细胞促进树突状细胞的增殖

目的建立小鼠子宫蜕膜基质细胞(DSC)和小鼠骨髓来源的树突状细胞(DC)细胞共培养体系,探讨DSC对DC增殖的影响。方法应用白细胞介素-4(IL-4)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)诱导小鼠骨髓细胞分化为DC,FACS检测细胞表面分子和细胞增殖,ELISA检测其分泌的细胞因子,构建DSC和DC共培养体系模型,动态观察DSC对DC增殖的影响。结果小鼠骨髓来源DC高表达CD11c,共刺激分子CD80和CD86,MHCⅡ类分子Ia和MHCⅠ类分子H-2Kb。经LPS刺激的DC分泌细胞因子IL-12(p70)、IL-6、TNF-α和IL-1β的水平明显上调(P<0.05),并能够促进抗原肽特异性T淋巴细胞增殖反应能力(P<0.05)。在DSC和DC共培养10天后观察到DSC明显促进DC增殖。结论小鼠子宫蜕膜基质细胞能够促进树突状细胞的增殖能力。

早孕期母-胎界面蜕膜基质细胞过表达肿瘤转移抑制基因KAI1/CD82导致妊娠失败

目的观察肿瘤转移抑制基因KAI1/CD82在自然流产绒毛和蜕膜组织中的表达情况,并建立蜕膜基质细胞(decidual stromal cell,DSC)与滋养细胞共培养模型,探讨KAI1/CD82在人母-胎界面的生物学作用。方法分别采用RT-PCR和Real-time PCR、免疫组化和Western blot技术分析KAI1/CD82在人早孕期正常妊娠和自然流产的绒毛和蜕膜组织中的转录及翻译水平。模拟体内微环境,建立了DSC和滋养细胞BeWo细胞株共培养体系,利用RNA干扰沉默DSC细胞KAI1/CD82表达,探讨DSC是否通过表达KAI1/CD82对滋养细胞侵袭性发挥调节作用。结果自然流产母-胎界面KAI1/CD82转录水平明显高于正常妊娠(P<0.05);自然流产的蜕膜组织KAI1/CD82蛋白表达也明显高于正常妊娠(P<0.05);而绒毛组织及滋养细胞不表达KAI1/CD82蛋白。采用RNA干扰技术成功沉默DSC细胞KAI1/CD82表达;KAI1/CD82基因沉默后,与DSC细胞共培养的BeWo细胞侵袭力显著增强。结论 DSC通过表达KAI1/CD82控制滋养细胞的侵袭,而一旦DSC异常过表达KAI1/CD82将导致滋养细胞侵袭力异常降低,最终可能导致自然流产的发生。

胎盘GM-CSF及蜕膜基板中滋养细胞、巨噬细胞与子痫前期的关系

【目的】探讨胎盘粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、蜕膜基板中滋养细胞、巨噬细胞的变化与子痫前期的相关性。【方法】采用免疫组化的方法检测24例子痫前期孕妇胎盘组织中的GM-CSF的相对含量以及蜕膜基板中滋养细胞、巨噬细胞的变化,并以22例正常初孕妇为对照。【结果】子痫前期组胎盘组织GM-CSF水平(11.06±1.83)明显高于对照组(5.45±1.11),P<0.001。子痫前期组蜕膜基板滋养细胞数(70.25±21.07)明显低于对照组(92.73±17.46),P<0.001。子痫前期组蜕膜基板巨噬细胞数(27.88±11.18)明显高于对照组(9.55±4.51),P<0.001。【结论】子痫前期患者胎盘组织GM-CSF水平较对照组明显升高、蜕膜基板中滋养细胞显著减少、巨噬细胞显著增多,可能与胎盘浅植入有关。

人绒毛外细胞滋养层细胞与蜕膜基质细胞共培养模型的建立

目的模拟体内环境,建立可保持绒毛外细胞滋养层细胞(EVCT)与蜕膜基质细胞(DSC)生物学特性的共培养细胞模型,应用于研究滋养细胞的侵袭行为。方法利用胰酶消化和BSA、Percoll梯度沉降,收集纯化人早孕绒毛组织的EVCT和DSC,分别放入Transwell的上下小室,观察该模型下细胞形态变化及侵袭特性,免疫组化、免疫荧光染色检测细胞的纯度。结果免疫组化显示EVCT的细胞角蛋白7阳性表达的细胞数占95%以上,阳性表达转化生长因子β2的细胞数占95%以上,DSC泌乳素阳性表达的细胞数也超过95%,证实共培养系统中EVCT和DSC纯度均在95%以上,且生物学特性得以维持。上室中的EVCT保持了其侵袭能力,在Matrigel包被的滤膜上EVCT的侵袭指数为3.22±0.04。结论适当的培养方法可获得高纯度的EVCT和DSC,并使其维持特有的生物学活性,成功地建立了共培养系统模型,便于研究滋养细胞侵袭和胚胎着床的机制。

维生素D对复发性流产患者早孕期蜕膜基质细胞分泌白细胞介素17、23水平的影响

目的分析维生素D对复发性流产(RSA)患者早孕期蜕膜基质细胞(DSC)分泌白细胞介素(IL)-23、IL-17水平的影响。方法收集5例RSA患者和5例正常早孕者的蜕膜组织,分离出DSC,行原代细胞培养后采用免疫细胞化学法进行鉴定。正常妊娠妇女的DSC加入溶媒无水乙醇(对照组);RSA患者的DSC分为等量的两部分:一部分加入溶媒无水乙醇(RSA组),另一部分加入以无水乙醇+1,25-二羟维生素D 3[1,25-(OH)2D 3](RSA+VD组)。培养24 h后,采用酶联免疫吸附试验法检测各组细胞培养上清中IL-23、IL-17水平。结果经免疫细胞化学法鉴定,DSC纯度接近100%,符合实验要求。RSA组DSC分泌IL-17水平高于对照组和RSA+VD组(P<0.05)。3组IL-23水平均超过了试剂盒的检测下限。结论RSA患者早孕期DSC分泌IL-17水平升高;1,25-(OH)2D 3可抑制DSC分泌IL-17,进而调节母-胎界面的免疫功能,发挥妊娠保护作用。

polyI:C促进小鼠蜕膜基质细胞死亡和IFN-β的表达

探讨polyI:C是否影响小鼠蜕膜基质细胞存活及其细胞因子的产生,为进一步阐明双链RNA或病毒诱导早孕期母体流产的潜在机制奠定基础。分离培养小鼠蜕膜基质细胞,polyI:C处理细胞24 h后,采用噻唑盐比色法(MTT)检测细胞存活率,Annexin V FITC流式细胞术(FCM)分析polyI:C诱导细胞的死亡方式,以及应用实时定量PCR分析polyI:C处理后IFN-β的表达情况。MTT检测结果表明2 mg/L polyI:C处理细胞后,细胞存活率显著降低(P<0.01),Annexin V FITC流式检测说明polyI:C诱导蜕膜基质细胞的细胞死亡方式以坏死和晚期凋亡为主,并且polyI:C可显著促进IFN-β的表达。提示双链RNA能显著促进小鼠蜕膜基质细胞的死亡和细胞因子IFN-β的表达。