miR-494调控成骨细胞分化及基质矿化的机制研究

目的探讨miR-494对成骨细胞分化及基质矿化的影响及相关机制。方法选择小鼠MC3T3-E1成骨细胞系,随机分为对照组、miR-494过表达组及miR-494抑制组。对照组不给予处理,miR-494过表达组及miR-494抑制组分别加入miR-494 mimics转染试剂、miR-494 inhibitors转染试剂进行细胞转染。采用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测各组细胞ALP活性,采用骨钙素放射免疫分析试剂盒检测各组细胞骨钙素(OC)活性。Vonkossa液染色检测各组细胞钙化结节数。qRT-PCR检测miR-494、磷酸酶张力蛋白同源物基因(PTEN)mRNA表达水平,Western blot检测细胞磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt通路蛋白表达水平,双荧光素酶报告实验验证miR-494与PTEN的靶向关系。结果双荧光素酶实验证实PTEN是miR-494的作用靶基因。miR-494过表达组成骨细胞miR-494 mRNA、p-Akt蛋白明显高于对照组,PTEN mRNA、ALP和OC活性、钙化结节数水平明显低于对照组;miR-494抑制组成骨细胞miR-494 mRNA、p-Akt蛋白明显低于对照组、miR-494过表达组,PTEN mRNA水平、ALP和OC活性、钙化结节数明显高于对照组、miR-494过表达组(P<0.05)。结论miR-494可有效抑制成骨细胞分化及基质矿化过程,其机制可能与miR-494介导靶基因PTEN调控Akt通路有关。

骨碎补提取液及柚皮甙对小鼠成骨细胞MC3T3-E1基质矿化作用影响的比较研究

目的比较骨碎补水、醇提取液及柚皮甙对小鼠成骨细胞MC3T3-E1基质矿化作用的影响。方法制备骨碎补的水、醇提取液。以小鼠成骨细胞株MC3T3-E1为细胞模型,用Von kossa钙化染色法了解上述药物提取液对成骨细胞基质矿化作用的影响。结果1 mg/L骨碎补水提液及0.01 mg/L骨碎补醇提液均可提高MC3T3-E1细胞体外钙化点面积百分比(P<0.05)。三组柚皮苷溶液作用组与对照组相比无明显区别。结论骨碎补水相和醇相提取物中分别存在有较高活性的促成骨细胞基质矿化的物质。

microRNA-494通过TLR-4通路抑制成骨细胞分化及基质矿化的分子机制

目的探讨microRNA-494(miR-494)通过Toll样受体-4(TLR-4)通路抑制成骨细胞分化及基质矿化的分子机制。方法选用小鼠成骨细胞株MC3T3-E1作为体外模型,采用miR-494 mimic转染小鼠成骨细胞株MC3T3-E1,采用qRT-PCR法测定miR-494在小鼠成骨细胞株MC3T3-E1转染前后的表达情况;通过MTT法检测转染前后小鼠成骨细胞株MC3T3-E1的增殖情况;通过测定碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,研究小鼠成骨细胞株MC3T3-E1的分化情况;通过骨钙素(osteocalcin,OC)定量检测分析和Von Kossa钙化染色检测小鼠成骨细胞株MC3T3-E1的基质矿化情况;通过Western blot等检测转染前后TLR-4蛋白的表达差异。结果 qRT-PCR测定结果显示,与阴性对照组相比,小鼠成骨细胞株MC3T3-E1转染后的miR-494的mRNA的表达量升高(P<0.05),说明miR-494 mimic转染小鼠成骨细胞株MC3T3-E1,成功使miR-494过表达。与阴性对照组相比,经过miR-494 mimic转染后,小鼠成骨细胞株MC3T3-E1的增殖能力受到抑制(P<0.05)。转染后的小鼠成骨细胞株MC3T3-E1中ALP的活性降低(P<0.05)。同时,转染后的小鼠成骨细胞株MC3T3-E1中OC的活性显著降低(P<0.05),矿化结节的数目、减少(P<0.05)。Western blot结果显示,与阴性对照组相比,miR-494 mimic转染组细胞中的TLR-4蛋白表达量显著升高(P<0.05)。结论 miR-494能够通过TLR-4通路抑制小鼠成骨细胞株MC3T3-E1的增殖活力,降低细胞中ALP、OC的活力,减少成骨细胞中的矿化结节数,抑制成骨细胞分化及基质矿化。

miR⁃26a⁃5p靶向PTEN基因影响成骨细胞分化及基质矿化

目的探究微小RNA-26a-5p(miR-26a-5p)对第10染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因(PTEN)的靶向作用及对成骨细胞分化及基质矿化的影响。方法通过在线软件预测miR-26a-5p与PTEN基因的结合位点,并经双荧光素酶报告基因检测验证。取生长状态良好的MC3T3-E1细胞,分为miR-26a-5p模拟物(mimic)组、miR-26a-5p mimic阴性对照(NC)组、pcDNA3.1-PTEN组、miR-26a-5p+pcDNA3.1-PTEN组,通过MTT法检测细胞增殖、碱性磷酸酶活性测定研究细胞分化情况、骨钙素定量检测分析和茜素红染色观察细胞基质矿化情况、Western blot检测成骨分化标志物和Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路蛋白表达变化。结果与NC组比较,miR-26a-5p mimic组miR-26a-5p水平、细胞增殖率、碱性磷酸酶活性、Ⅰ型胶原(ColⅠ)、骨桥蛋白(OPN)、骨钙素、矿化率及β-catenin表达升高,PTEN mRNA及蛋白表达和糖原合成酶激酶-3b(Gsk-3b)表达降低(P<0.05),pcDNA3.1-PTEN组PTEN mRNA及蛋白表达和Gsk-3b表达升高,细胞增殖率、碱性磷酸酶活性、ColⅠ、OPN、骨钙素、矿化率及β-catenin表达降低(P<0.05);与miR-26a-5p mimic组比较,miR-26a-5p+pcDNA3.1-PTEN组PTEN mRNA及蛋白表达和Gsk-3b表达升高,细胞增殖率、碱性磷酸酶活性、ColⅠ、OPN、骨钙素、矿化率及β-catenin表达降低(P<0.05)。结论miR-26a-5p可靶向下调PTEN表达,调控Wnt/β-catenin信号通路,促进成骨细胞增殖、分化及基质矿化。

地黄活性成分梓醇对小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化和矿化的影响

目的检测地黄活性成分梓醇对成骨细胞株MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化的影响。方法制备不同浓度地黄活性成分梓醇提取液。以小鼠成骨细胞株MC3T3-E1作为药物筛选的细胞模型;用MTT法测定不同浓度的梓醇溶液的促细胞增殖作用;采用ALP活性和骨钙素定量检测分别观察不同浓度的梓醇溶液的促细胞分化作用;以Vonkos-sa钙化染色法了解不同浓度的梓醇溶液的促细胞钙化作用。结果梓醇在1×10-7～1×10-9mol·L-1浓度范围内培养24及48h促进成骨细胞株MC3T3-E1细胞增殖。梓醇在浓度1×10-5～1×10-6mol·L-148及72h提高成骨细胞株MC3T3-E1细胞内碱性磷酸酶的活性。梓醇在浓度1×10-5～1×10-6mol·L-1培养8及12d时能明显促进成骨细胞MC3T3-E1骨钙素合成和分泌。梓醇在浓度1×10-5～1×10-6mol·L-1培养19d时成骨细胞株MC3T3-E1细胞的矿化结节(mineralized bone nodular structure,MBNS)数目增多。结论梓醇可以提高成骨细胞株MC3T3-E1增殖和分化能力,梓醇可能是地黄治疗骨质疏松作用的活性成分之一。

新疆马鹿角提取物对成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化和矿化的影响

目的研究新疆马鹿角提取物对体外培养成骨细胞株MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化的影响。方法以MC3T3-E1细胞作为药物筛选模型,用MTT法测定不同浓度的新疆马鹿角提取物促细胞增殖作用,采用碱性磷酸酶活性测定和骨钙素含有量检测,观察不同浓度的新疆马鹿角提取物促细胞分化作用,以Von kossa钙化染色法观察新疆马鹿角提取物溶液对MC3T3-E1细胞钙化能力的影响。结果 MTT检测结果表明5×102、5×101、5μg/mL新疆马鹿角提取物溶液在24、48、72 h均可促进MC3T3-E1细胞增殖,且呈时间依赖性。ALP检测结果表明5×102、5×101μg/mL新疆马鹿角提取物溶液在24、48、72 h可提高MC3T3-E1细胞内ALP的活性。BGP检测结果表明5×102、5×101μg/mL新疆马鹿角提取物溶液在8、12 d可促进MC3T3-E1细胞内BGP的合成和分泌。Von kossa染色钙化面积百分比结果表明3组新疆马鹿角提取物溶液与对照组比较无明显区别。结论 新疆马鹿角提取物可促进成骨细胞株MC3T3-E1的增殖和分化能力。

特发性低血磷性骨软化症1例

成年人的骨软化症是一种罕见的以骨基质矿化障碍为特点的一种慢性骨骼疾病，其结果导致非矿化的骨样组织（类骨质）堆积，骨质软化，而产生肌无力、骨痛、骨畸形、骨折等一系列临床症状和体征。病因复杂，临床上易被误诊、漏诊，甚至造成严重后果，现将中山大学附属汕头市中心医院收治的首例特发性低磷血致全身骨软化病例报告如下。

口腔颌面部骨肉瘤中非胶原蛋白的表达与肿瘤分化

目的 探讨骨钙蛋白 (OC)、骨涎蛋白 (BSP)、骨桥蛋白 (OPN)在骨肉瘤细胞分化与基质矿化中的意义。方法 采用免疫组化方法检测OC、BSP、OPN在 5 0例各型骨肉瘤肿瘤细胞、基质中的表达。结果 成骨细胞型、成软骨细胞型、成纤维细胞型骨肉瘤肿瘤细胞中 ,除成纤维细胞型BSP、OPN的高表达率 (分别为 30 .0 %、10 .0 % )显著低于成骨细胞型 (分别为 75 .0 %、6 4.3% )外 ,其它各型中OC、BSP、OPN的表达无显著差异。未矿化肿瘤骨基质中 ,三者均呈低表达。矿化骨基质中 ,BSP、OPN的高表达率 (81.4%、76 .7% )显著高于OC(4.6 % )。晚期正常成熟骨中 ,OC的表达显著增高。结论 在骨肉瘤肿瘤细胞中 ,OC、BSP、OPN的表达与肿瘤细胞的分化有关。在肿瘤骨基质的形成及钙化过程中 ,非胶原蛋白与基质矿化的关系更为密切 ,且BSP、OPN、OC的表达出现了一定的时序性。

骨质量与骨质疏松症

骨质量即骨的材料性能,决定于骨矿盐及有机基质的组成,还与骨微构筑、骨转换率、胶原交联的类型、基质矿化程度、微损害聚集及细胞活性等有关。本文将从骨的矿盐及有机基质、骨重建、骨的微损害及微裂隙、骨脆性及脆性骨折等方面进行综述,进一步阐明骨质量与骨质疏松的关系。

脂多糖对诱导分化的牙髓细胞形成矿化基质的影响

目的研究脂多糖对诱导分化的牙髓细胞牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprolein，DSPP）、骨钙素基因表达及碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性的影响。方法以脂多糖作用于诱导分化的牙髓细胞，用荧光定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测DSPP、骨钙素mRNA的表达，ALP试剂盒检测ALP活性改变。结果诱导分化的牙髓细胞在脂多糖刺激后ALP活性由（1156，10±100，60）pmol·h^-1·ng^-1下降为（884．80±26，72）pmol·h^-1·ng^-1，荧光定量RT-PCR显示脂多糖能显著抑制DSPP和骨钙素mRNA表达，其中DSPP拷贝数由（176301．62±13269．77）下降为（39396，32±12018．08），骨钙素拷贝数由（4971．46±483，91）下降为（1104.67±63．37）（t=7．922，P〈0．001）。结论脂多糖能显著降低诱导分化的牙髓细胞合成有机基质。

人皮质骨矿化基质中骨盐框架结构

目的：研究人皮质骨矿化基质中骨盐的框架结构及框架中骨微间隙。方法：应用透射电镜、场发射扫描电镜观察、电脑图像分析及能谱分析，分析无骨病成人长骨、扁骨２００例骨盐分布特征。结果：骨盐框架结构由微柱、微梁、微小梁、弓状梁、致密点、隔板和骨微间隙构成。骨微间隙由洞、内衬和壁组成，洞平均直径为８４．４±７５．６ｎｍ，与骨小管相比有显著差异（Ｐ值＜０．００１），平均密度为１１～１７个／μｍ２，与骨小管之比超过１０：１。骨盐分针形结晶和微颗粒结晶。结论：骨盐框架结构及骨微间隙是骨盐在人皮质骨矿化基质中的存在形式，可能与骨盐吸收、沉着有关。

佝偻病和骨软化症

佝偻病是骨骼成长过程中骨基质矿化障碍导致的一系列临床表现。骨软化症是骨骼生长板愈合以后（即成年人期）出现的上述变化。

佝偻病和骨软化

佝偻病是生长中骨骼骨基质矿化障碍的临床结果，可累及婴儿、儿童和发育期青少年。骨软化症是发生在生长板闭合后(如成人)的相同疾患。

力学刺激对大鼠成骨细胞Integrins α_2、β_1、β_3表达和细胞增殖、合成功能的影响

探讨在成骨细胞中 Integrins调节力学信号转导可能的分子机制和周期性双轴力学应变对成骨细胞增殖与合成功能的影响。将 3月龄雌性 SD大鼠颅顶骨分离的成骨细胞在含 10 %胎牛血清的 F- 12培养液中培养并接种在 Flexercell type I dish中。当细胞生长至亚融合状态 (Subconfluence) ,给细胞施加力学刺激 ,频率为 1Hz,力学刺激分别为 4 0 0、10 0 0、4 0 0 0 μ strain;作用时间分别为每天 30 m in,2 h,4 h,和 8h,共加载 2 d。以未受力学刺激的细胞为对照组 ,受力学刺激的细胞为实验组 ,并进行比较。采用流式细胞技术测定和分析 Integrinsα2 ,β1 ,β3在成骨细胞膜上的表达量、细胞周期分布与细胞增殖变化 ;采用同位素标记方法检测成骨细胞骨钙素、I型胶原 C端前肽 (PICP)和总蛋白的分泌量。结果表明 :(1)在 3月龄雌性 SD大鼠成骨细胞膜表面有 Integrinsα2 ,β1 ,β3的表达 ,β1的表达最高。 (2 )周期性双轴力学应变对 3月龄雌性 SD大鼠成骨细胞膜表面 Integrinsα2 ,β1 ,β3的表达量有明显上调作用 ,但不同强度、不同作用时间的力学应变对成骨细胞膜表面 Integrinsα2 ,β1 ,β3表达量上调的作用亦不相同 ,而 β3对力学刺激最敏感 ;在 4 0 0 0 μ strain力学刺激下 ,成骨细胞膜表面 Integrinsα2 。

中药地龙提取液的促成骨作用及对实验性牙槽骨吸收疗效的研究

探讨了中药地龙水提液和醇提液有无促进成骨细胞增殖、分化和基质矿化的作用及对大鼠牙槽骨吸收疗效进行了研究.制备地龙的水相及醇相提取液,以小鼠成骨细胞株MC3T3-E1作为体外药效的试验模型,分别通过MTT法,流式细胞术,碱性磷酸酶活性测定,骨钙素检测和Vonkossa基质矿化染色法观察上述药物的促细胞增殖、分化、基质矿化作用.以实验牙位龈正中注射脂多糖建立的SD大鼠实验性牙槽骨吸收作为体内药效试验模型,通过组织切片形态学骨密度观察和抗酒石酸酸性磷酸酶染色评价上述药物对大鼠实验性牙槽骨吸收的疗效.结果发现:1mg.L-1水提液,0.01mg.L-1和1mg.L-1醇提液能显著促进MC3T3-E1细胞增殖.各浓度的水提液和醇提液均能使S期细胞百分率升高,G1期细胞百分率减少.0.01mg.L-1水提液和1mg.L-1醇提液作用于细胞的第1～3d内、100mg·L-1醇提液作用第7～9d内、100mg·L-1水提液作用第10～12d内可显著提高细胞骨钙素合成和分泌.0.01mg·L-1水提液和醇提液,1mg·L-1水提液可显著促进细胞体外基质矿化.地龙水提液和醇提液组的骨密度均有显著增高,破骨细胞数显著降低.阴性对照组至第30d时牙槽骨仍可见大量破骨细胞.结果表明:地龙水相和醇相提取物中均存在较高活性的促成骨细胞增殖、分化和基质矿化的物质,且对实验性牙槽骨吸收模型有一定治疗作用,可抑制其牙槽骨吸收,促进成骨活动使其修复重建.

柚皮苷对小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化和矿化的影响

目的:检测骨碎补有效成分柚皮苷对成骨细胞株MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化的影响。方法:以成骨细胞株MC3T3-E1细胞为体外药效的试验模型(药物组和对照组),通过CCK-8法观察10,1,0.1,0.01,0.001,0.000 1μmol.L-1的柚皮苷溶液对MC3T3-E1细胞增殖能力的影响;通过乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性试验观察以上浓度的柚皮苷溶液对细胞毒性能力的影响。通过骨形成蛋白-2(BMP-2),碱性磷酸酶(ALP)活性测定和骨钙素(OC)含量测定观察柚皮苷对MC3T3-E1细胞分化能力的影响;通过Von kossa钙化染色法观察柚皮苷对MC3T3-E1细胞钙化能力的影响。结果:高浓度的柚皮苷溶液在12 h和24 h时能促进MC3T3-E1细胞的增殖作用。而低浓度的柚皮苷溶液则无此作用。所测的各个组别细胞毒性百分比都较小,且随着时间的推移(12,24,48 h)变化较小。光镜下观察各个时间点细胞的密度和形态也未发生明显的变化。BMP-2细胞免疫化学结果表明,24,48 h时柚皮苷浓度10,1,0.1μmol.L-1包浆内棕色着色比对照组明显。ALP检测结果表明48 h时,1,0.1μmol.L-1的柚皮苷溶液可提高MC3T3细胞的ALP活性(P<0.05)。72 h时,0.1μmol.L-1的柚皮苷溶液可提高MC3T3细胞的ALP活性(P<0.05)。OC检测结果表明12 d时,10,1μmol.L-1柚皮苷溶液作用组与对照组相比OC活性明显提高(P<0.05)。Vonkossa染色钙化面积百分比结果表明3组柚皮苷溶液作用组与对照组相比无明显区别。结论:柚皮苷溶液可以提高成骨细胞株MC3T3-E1增殖能力和分化能力。

骨桥蛋白在心脏重构中的作用研究进展

骨桥蛋白（osteopontin，OPN）为磷酸化糖蛋白，在多种细胞有表达。Oldberg等通过对大鼠骨肉瘤涎蛋白互补脱氧核糖核酸克隆而分离出来的一种酸性蛋白并命名为OPN。最初了解其介导骨细胞与骨基质的连接，在骨基质矿化及重吸收过程的作用。其在巨噬细胞、内皮细胞、

骨桥蛋白与炎症性肠病

骨桥蛋白（osteopontin，OPN）是一种具有多种功能的分泌型钙结合磷酸化糖蛋白，又称为早期T淋巴细胞活化因子1（early Tlymphocyteactivation 1，Eta-1）或分泌型磷酸蛋白。1979年Senger等首次报道一种转化特异性分泌蛋白与肿瘤的关系．称之为转化相关性磷酸蛋白。后来Franzen等从骨组织中分离出一种磷酸蛋白，其特性与Senger等发现的磷酸蛋白相似．因其介导骨基质矿化和重吸收过程而被命名为骨桥蛋白。以后相继在多种组织细胞中均发现OPN的表达和分泌，并参与多种生命现象。现在认为，在局部炎症中，它是免疫细胞募集及启动Th1细胞免疫的关键细胞因子。