基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱快速检测生菜中嗜麦芽窄食单胞菌

目的评价基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)在即食果蔬中微生物风险监测的应用价值,确定生菜中的危害微生物及蛋白指纹图谱特征。方法对成都地区50份生菜样品进行微生物的检测,对分离的嗜麦芽窄食单胞菌进行生化鉴定和MALDI-TOF MS鉴定,采用维恩分析(包括小于0.85‰偏差)对生菜中分离的嗜麦芽窄食单胞菌指纹图谱进行拟合,采用系统聚类法对分离的嗜麦芽窄食单胞菌指纹图谱进行聚类分析。结果50份生菜样品中检出11株嗜麦芽窄食单胞菌,MALDI-TOF MS获得其蛋白图谱拟合出特征性标识峰指纹图16组,与数据库中超级谱图比对有9组不同标识峰,为生菜分离菌特征峰;蛋白指纹图谱聚类结果表明嗜麦芽窄食单胞指纹图谱有一定来源指向性,但仍需更多数据修正。结论嗜麦芽窄食单胞菌在生菜中检出率较高,可作为危害风险特征微生物继续研究,MALDI-TOF MS可获得更多农产品中致病微生物特征信息,作为农产品危害识别微生物快速鉴定及差异性分析应更深入的研究和扩大数据量,并建立农产品微生物数据库系统。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在食源性致病菌鉴定中的应用

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)作为近年来发展的新型食源性致病菌鉴定技术,具有灵敏、准确、检测速度快等优点,该技术为食品病原微生物靶标性监测和食品安全事件应急检验提供了一种高效的鉴别技术参考,在保障民众生命健康和经济社会发展上发挥了重要作用。本文检索了近年来国内外MALDI-TOF MS技术在食源性致病菌检测中的相关研究案例,简要综述了MALDI-TOF MS检测原理、工作流程,影响鉴定结果的主要因素,介绍了MALDI-TOF MS技术应用于食源性致病菌检测中的实际案例,在此基础上分别从参考菌株数据库建设、标准化程序规范等方面对MALDI-TOF MS技术在食源性致病菌检测领域的未来研究方向进行展望,以期为后续食品安全检测及快速监管食源性致病菌污染提供技术支持。

采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱快速检测产KPC大肠埃希菌ST131和ST405分型的研究

目的采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)快速检测产KPC大肠埃希菌ST131、ST405,并对该方法的可行性进行评价。方法收集浙江省人民医院临床分离46株大肠埃希菌,扩增blaKPC耐药基因,采用多位点序列分型方法(MLST)进行分型。MALDI-TOF MS对大肠埃希菌进行鉴定并对不同克隆的峰图进行主成分分析和算法统计,获得分型区分的特征峰。结果 46株KPC型大肠埃希菌均携带KPC-2耐药基因,MLST方法检测到2种ST型,分别为ST131和ST405。主成分分析图显示ST131和ST405可分为2簇,其中2株ST131和3株ST405分类错误。ClinProTools软件4种算法结果基本相似,方法特异度和灵敏度分别为93.27%和97.92%。用于区分ST131和ST405的特征峰主要为8 331.84、4 166.44、4 860.21和2 783.66 Da。这4个峰区分具有统计学意义,有较高准确性。结论采用MALDI-TOF MS可快速区分产KPC大肠埃希菌ST131和ST405,具有操作简单、耗时短、区分灵敏度和特异度高以及成本低等优点,能用于大肠埃希菌克隆分型研究。

应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌对厄他培南的水解能力

目的应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)检测产KPC-2、NDM-1、VIM-2、IMP-1与IMP-4型碳青霉烯酶肠杆菌科细菌水解厄他培南的能力。方法收集2009年6月-2013年12月上海交通大学医学院附属新华医院各种临床标本中分离的耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(CRE),用改良Hodge试验进行产碳青霉烯酶的表型筛选,用PCR扩增方法检测其碳青霉烯酶基因,并经测序确认。应用MALDI-TOF MS进行厄他培南水解预试验以确定最适厄他培南浓度及孵育时间,随后采用预试验中的最适条件,应用MALDI-TOF MS检测CRE水解厄他培南的能力。结果 108株CRE中,有102株改良Hodge试验阳性,其中90株产KPC-2、4株产NDM-1、3株产VIM-2、2株产IMP-1、2株产IMP-4、1株同时产KPC-2和IMP-4型碳青霉烯酶,且在2 h内均能水解厄他培南;另外6株CRE改良Hodge试验阴性,未检测出上述碳青霉烯酶基因,且不水解厄他培南。结论临床微生物实验室应用MALDI-TOF MS能够快速准确检测CRE水解厄他培南的能力,筛查产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌,为临床早期合理使用碳青霉烯类抗生素提供依据。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法测定大蒜寡糖和多糖分子质量分布

研究大蒜多糖的分子质量分布,探索获得适宜于结构研究的不同分子质量分布的大蒜多糖样品的方法。利用不同体积量的丙酮和乙醇为沉淀剂,得到一系列不同分子质量的大蒜多糖样品,并利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)法测定各样品的分子质量分布。结果表明,不同体积量的丙酮与乙醇分解沉淀所获得的样品中都含有低聚糖和多糖,糖的分子质量分布在362～2811u之间;丙酮对大蒜多糖的沉淀能力比乙醇好,3倍体积丙酮的多糖提取液所获得样品中低聚糖的含量高于4倍体积的乙醇。因此,通过调整丙酮或乙醇的的比例可得到不同分子质量分布的大蒜寡糖、多糖。

基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法快速测定米饭和乳制品中蜡样芽孢杆菌呕吐毒素Cereulide

建立基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)法分析蜡样芽孢杆菌呕吐毒素Cereulide的快速检测方法。分析了Cereulide标准物质的裂解规律,考察基质种类、点靶方式、基质溶剂和用量、激光强度等对Cereulide的质谱信号强度的影响,并进行方法学验证和实际样品检测。结果表明,选择以α-氰基-4-羟基肉桂酸为基质,均匀分散在50%乙腈-水(含0.1%三氟乙酸)中,采用先点基质再点样品的点样方式,反射线性正离子模式下选择激光强度70%进行食品中MALDI-TOF MS筛查时,可检测到Cereulide的[M+Na]^(+)和[M+K]^(+)目标离子峰,此质谱信号稳定、强度高、响应重复性好。方法学验证结果表明,Cereulide的[M+Na]^(+)和[M+K]^(+)目标离子峰在5~100 ng/mL范围内线性好,相关系数(r)>0.99;方法的检出限分别为3.0 ng/g和5.0 ng/g;对米饭和牛乳样品的加标回收率为73.3%~118.2%,相对标准偏差为0.3%~10.9%(n=6)。本方法分析速度快、准确性高、灵敏度好、抗干扰能力强、无需内标即可实现对米饭和乳制品中Cereulide的批量筛查和检测。

半夏炮制过程中毒性凝集素蛋白的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)受灵敏度和重复性的影响,对完整蛋白的定量分析存在困难。本研究采用纤维素纳米晶体(CNC)辅助MALDI-TOF MS,结合内标法定量分析半夏炮制过程中半夏凝集素(PTL),通过优化CNC辅助样本制备的时长和比例,以麦胚凝集素(TVL)为内标,直接分析不同炮制程度半夏各炮制品及其浸泡上清液中PTL含量。结果表明,CNC辅助MALDI样本制备有效提升了MALDI-TOF MS定量分析的线性和重复性。随着炮制时间的延长,姜半夏、清半夏和法半夏炮制品的PTL含量逐渐下降,浸泡上清液中PTL含量逐渐上升。其中,由于pH值的改变,法半夏炮制品浸泡上清液中PTL含量呈先上升后下降的趋势。此外,将该方法应用于不同饮片生产企业的多批次半夏炮制品饮片中,均未检出PTL。该方法操作简便,可有效分析半夏炮制过程中PTL含量的变化,为研究半夏炮制过程对PTL的影响提供了参考。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱快速检测ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌

目的采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)筛选并验证ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌的特异峰,建立快速检测此型别肺炎克雷伯菌的方法。方法收集前期已进行碳青霉烯酶基因检测和多位点序列分型(MLST)的118株肺炎克雷伯菌作为特异峰筛选组,其中ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌67株,非ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌51株,采用Clinpro Tools 3.0软件和Flex analysis 3.0图谱分析软件筛选出ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌的特异峰;再收集前期已进行碳青霉烯酶基因检测和MLST的另外89株肺炎克雷伯菌作为特异峰验证组,严格按照试验条件获得质量图谱,对特异峰的特异性进行验证并进行重复性试验;最后随机收集95株肺炎克雷伯菌临床分离株及其临床鉴定图谱,利用特异峰直接判断菌株是否为ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌,同时对菌株进行碳青霉烯酶基因检测和MLST,以评估特异峰的临床应用价值。结果利用分析软件筛选获得ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌的最佳特异峰为m/z 4 521;在试验条件下,以该峰作为检测此型别细菌的特异峰,其特异性和敏感性分别为98.1%和97.3%,且该特异峰的重复性达97.4%;采用临床鉴定图谱对特异峰的临床应用价值进行评估,其特异性和敏感性分别为95.2%和96.9%。结论 MALDITOF MS可检出ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌的特异峰m/z 4 521。可依据细菌鉴定图谱是否存在此特异峰来直接检测ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌,该特异峰具有较高的特异性和敏感性,可快速、准确地为临床合理、有效的治疗和医院感染的控制提供依据。

应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱和N端测序鉴定重组人粒/巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的结构

目的 :应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 (MALDI -TOF -MS)和N端测序方法鉴定重组人粒 /巨噬细胞集落刺激因子 (rhGM -CSF)的结构。方法 :1 用Edman降解法进行N端测序。 2 应用MALDI-TOF -MS测定分子量并鉴定纯度。 3 通过还原、烷基化确定rhGM -CSF分子中二硫键数目。 4 通过蛋白内切酶Glu -C酶切的肽质量指纹谱确证氨基酸序列并确证其中两对二硫键的配对。结果 :1 测定的rhGM -CSFN端 15个氨基酸序列与从cDNA推导的序列一致。 2 测定的rhGM -CSF分子量与理论计算值一致。 3 证明rhGM -CSF没有自由巯基 ,含有两对二硫键 ,与理论值一致。 4 证明rhGM -CSF的氨基酸序列是正确的 ,并确证其中的两对二硫键配对正确。结论 :确证重组人粒 /巨噬细胞集落刺激因子 (rhGM -CSF)的结构是正确的 ,没有修饰、变异和氨基酸的丢失。应用的方法灵敏、准确。

基质辅助激光解析飞行时间质谱分析条件及准确度对蛋白质数据库搜索结果的影响

考察了基质辅助激光解析飞行时间质谱获得肽质量指纹谱(PMF)时主要分析条件及准确度对蛋白质数据库搜索结果的影响。将牛血清白蛋白(BSA)经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离、酶解;肽段经质谱分析得PMF数据;用MS-Fit引擎在相同数据库及参数下搜索。得出:(1)激光脉冲击打次数在300次以前时,蛋白序列和肽段覆盖率逐步增加;当击打400次时,覆盖率呈下降趋势;(2)随着激光强度增加,目标蛋白得分、氨基酸序列和肽段的覆盖率逐步增加,但当强度增到1413时,则呈现降低趋势;(3)随延迟时间的增加,肽覆盖率呈递增趋势,但当达260ns后呈下降趋势。按照优化的分析条件对同一位点重复3次,重复性良好。通过对质谱数据准确度的考察,发现以Mix2为外标,数据跟标准值差异越小时,则经其校正后的肽段数据所搜索目标蛋白的得分越高、排序靠前、检出预选蛋白个数越少,可信度越高;反之,难获得候选蛋白。结果表明:质谱准确度和分析条件对蛋白质数据库搜索影响显著。

基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱对临床常见细菌和酵母菌的鉴定能力评价

目的利用基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)和VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定及药敏系统、ATB Expression微生物鉴定及药敏系统鉴定临床常见的细菌和酵母菌,比较鉴定结果的一致性,评价MALDI-TOF MS对临床常见病原菌的鉴定能力。方法连续5 d鉴定123株临床分离株,其中革兰氏阳性菌42株,革兰氏阴性菌71株,酵母菌10株。细菌鉴定同时使用法国梅里埃公司的VITEK MS(采用MALDI-TOF MS技术)和VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定及药敏系统,酵母菌鉴定同时使用VITEK MS和ATB Expression微生物鉴定及药敏系统。将MALDI-TOF MS与传统生物化学方法得到的鉴定结果进行比较,结果不一致的菌株采用16S r RNA测序验证。结果 MALDI-TOF MS与传统生物化学方法得到的鉴定结果相比较,革兰氏阳性菌鉴定符合率为78.6%(33/42),革兰氏阴性菌鉴定符合率为84.5%(60/71),酵母菌鉴定符合率为100.0%(10/10)。其中金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肠球菌及大多数肠杆菌科细菌、非发酵菌的符合率可达95.0%。19株鉴定结果在种的水平上不一致的细菌经16S r RNA测序验证,MALDI-TOF MS的正确率为73.7%,传统生物化学鉴定结果的正确率为49.2%。结论与传统生物化学鉴定手段相比,MALDI-TOF MS对临床常见致病菌具有较好的鉴定能力,鉴定时间显著缩短,可实现临床微生物的快速、准确鉴定。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱在革兰阴性杆菌对β内酰胺类抗生素耐药性检测中的应用进展

β内酰胺类抗生素是一类临床应用最为广泛的抗菌药物,它通过干扰细菌细胞壁肽聚糖的交联结构发挥杀菌作用。该类抗生素包括青霉素及其衍生物、头孢菌素、单酰胺环类和碳青霉烯类等,其中尤以碳青霉烯类抗生素的抗菌活性最强。2013年CHINET细菌耐药性监测数据显示：肠杆菌科细菌对头孢菌素的耐药率约为20%,对碳青霉烯类抗生素的耐药率接近7%;不发酵糖革兰阴性杆菌对头孢菌素和碳青霉烯类抗生素耐药率均接近50%。

基于激光解析/离子化-飞行时间质谱技术的中药阿胶蛋白质组分析

目的:应用激光解析/离子化-飞行时间质谱技术对传统中药阿胶蛋白/肽成分进行蛋白质组初步分析,建立阿胶蛋白质质量指纹图。方法:实验于2004-06/2005-03在湖南中医药大学蛋白质组学实验室完成。采用饱和硫酸胺沉淀,透析脱盐冻干法获得阿胶水溶性蛋白/肽,采用Ciphergen BiosystemsInc.ProteinChipRBiology System(美国PBSⅡ+)及配套的NP10芯片、激光解析/离子化-飞行时间质谱技术,分析阿胶Mr1500～13000区间蛋白质、肽分布及其相对分子质量。结果:Mr2000～4000区间显示4个相对分子质量峰,可能是2种肽;Mr4000～5000区间显示8个相对分子质量峰,可能为2种肽;Mr5000～5500区间显示16个相对分子质量峰,约为3种肽;Mr5500￣6200区间无峰;Mr8100～8200区间显示5个相对分子质量峰,可能为1种肽;Mr11200～11400区间显示5个相对分子质量峰,可能为1种蛋白质。不同质量浓度稳定获得的有意义蛋白/肽共计9个。不同相对分子质量肽之间差分别提示可能为丙氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸残基相对分子质量。结论:通过分析,可以形成阿胶蛋白质/肽成分质量指纹图,可作为阿胶数字化质控标准;并为进一步分离、纯化及验证阿胶功能相关活性蛋白质/肽组分提供可靠信息。

基质辅助激光解析飞行时间质谱在临床病原菌检测中的应用进展

近年来质谱仪技术有了快速的发展。20世纪80年代,基质辅助激光解析飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS）的诞生,奠定了基于蛋白质指纹图谱鉴定微生物的硬件基础。每种微生物都有自身独特的蛋白质组成,

基质辅助激光解析电离-串联飞行时间质谱与电喷雾离子化-四极杆-飞行时间质谱分析蛋白质

为比较基质辅助激光解析电离-串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF)和电喷雾离子化-四极杆-飞行时间质谱(ESI-Q-TOF)在蛋白质定性和定量分析方面的性能,分别利用两种仪器对用于相对和绝对定量的等量异位标签(iTRAQ)标记的雌激素刺激前后MCF7细胞内的蛋白质水解产生的多肽进行了定性和定量分析。结果表明,用MALDI-TOF-TOF和ESI-Q-TOF方法分别鉴定出1086种和848种蛋白质,其中相同的蛋白质为633种;MALDI-TOF-TOF和ESI-Q-TOF方法分别找到38种和33种表达差异在0.5倍以上的蛋白质,其中3种为相同的蛋白质。实验数据说明,两种仪器在蛋白质定性和定量分析方面有很大的互补性,将两种仪器结合使用,不仅能够显著提高蛋白质定性和定量分析的覆盖率,而且可提高分析的置信度。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪在快速鉴定临床酵母菌中的应用

目的目前酵母菌的实验室检测方法往往鉴定周期长、操作繁琐、阳性率低,不能满足临床快速诊断和及时治疗的需要。文中探讨基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)用于快速鉴定临床分离酵母菌的可行性。方法收集南京军区南京总医院2013年7-10月自临床标本分离的非重复酵母菌120株。分别使用MALDI-TOF-MS和Vitek 2-Compact全自动微生物分析系统或API酵母菌鉴定条进行鉴定,结果不一致的菌株采用ITS基因测序验证。结果 120株酵母菌中117株(97.5%)MALDI-TOF-MS正确鉴定到种水平,2株(1.7%)未给出鉴定结果,1株(0.8%)鉴定结果不一致的菌株经ITS基因测序确认,MALDI-TOF-MS和Vitek 2-Compact/API均鉴定错误。结论 MALDI-TOF-MS可以作为一个快速、准确和价廉的工具应用于临床酵母菌的鉴定。

氧化硅介孔材料在基质辅助激光解析飞行时间质谱分析有机小分子中的应用

研究了表面修饰的无机有机复合型介孔材料SBA-15-NA(1,8-Naphthalimide)作为基质在MALDITOF-MS分析中的应用。采用1,8-萘酰亚胺修饰SBA-15,1,8-萘二甲酸酐先与3-三甲氧基硅基-1-丙胺反应,得到的产物再修饰到SBA-15,得到SBA-15-NA,应用修饰后的介孔材料SBA-15-NA为基质获得了具有背景离子干扰少、离子化效率高、更高的峰值强度等优点的谱图。甲醇作为溶剂,分析物和基质的浓度比例为1∶10,采用以样品和基质等体积混合均匀点样方法,对低糖类、氨基酸类、植物激素生物代谢物和药物等不同结构的小分子化合物(分子量小于500)进行了MALDI-TOF-MS分析。在此优化的条件下得到了低检出限1×10-9g/L(亮氨酸,信噪比为5)和高重现性(≤30%)。采用衍生化的复合型介孔材料直接测定了实际尿样。

基质辅助激光解析飞行时间质谱快速测定水解胶原蛋白粉分子量

应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)快速测定了水解胶原蛋白粉的分子量。分别以α-氰基-4-羟基肉桂酸、2,5-二羟基苯甲酸和芥子酸为基质,在正离子模式下对水解胶原蛋白粉分子质量分布进行测定。结果显示:芥子酸为最适宜基质,分析条件为线性方式和反射方式相结合,可准确、快速确定水解胶原蛋白粉的分子量分布。该方法优于其它传统的分子量测定方法。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱在血培养阳性标本鉴定方面的应用进展

如今,随着抗菌药物特别是广谱抗菌药物的广泛应用,细菌耐药问题已逐渐成为全球性问题。怎样及时而有效地选择抗菌药物成为临床医生面临的一个难题。特别是在菌血症或是脓毒症等严重感染患者中,早期选用敏感抗菌药物可以有效降低病死率。但传统的细菌鉴定多采用手工法,依靠形态学、革兰染色镜检和生物化学反应,速度慢,不能满足临床诊断和治疗的需要。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测β-内酰胺酶的研究进展

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是一种检测微生物的新型工具,不仅可用于微生物的快速鉴定,而且还可以检测细菌的耐药机制。产β-内酰胺酶是革兰阴性杆菌耐β-内酰胺类抗菌药物的主要耐药机制,目前利用MALDI-TOF MS快速检测细菌β-内酰胺酶的技术已被广泛报道,方法主要有检测β-内酰胺酶水解β-内酰胺类抗菌药物的活性,直接检测β-内酰胺酶分子、肽段或其相关蛋白以及检测β-内酰胺酶基因的单核苷酸多态性等。该文结合最新的研究成果对MALDI-TOF MS在β-内酰胺酶检测中的应用现状进行综述。