基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术对非结核分枝杆菌的鉴定与分型

应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF MS),对非结核分枝杆菌菌株实施鉴定并对其分型。方法 通过收集2018-2023年从临床分离不同感染部分的菌株展开分析,提前需要确认培养物自身的抗酸阳性,然后开始培养可疑样本,采用 MALDI-TOF MS对罗氏培养基上的新鲜菌落进行鉴定。结果 在本次通过应PCR鉴定结果作为金标准,其中经鉴定能力进行显示,本次通过对鉴定结果进行比较中,其中对NTM鉴定符合成功率为90%,鉴定失败率为10%。通过对数据库进行不同分枝杆菌鉴定菌种率的变化比较,DB-164-Mycobacteria Library 5.0平均分值,经比较,和Bruker MBT-DB5989平均分值具有统计学差异(p<0.05)。结论 对NTM鉴定中采用DB-164-Mycobacteria Library 5.0能够进行快速鉴定,同时也是不可或缺的实验方法,同时也需要其他方法进行辅助鉴别。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测支气管肺泡灌洗液对非结核分枝杆菌肺病的诊断价值

目的 探讨基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)检测支气管肺泡灌洗液(BALF)对非结核分枝杆菌(NTM)肺病的诊断价值。方法 收集2020年1月—2021年12月安徽省胸科医院收治的112例疑似NTM肺病患者。对患者BALF行MALDI-TOF MS检测、PCR荧光探针检测、BACTEC MGIT 960分枝杆菌全自动快速液体培养(BD960法)检测,并对三种检测技术诊断效能进行比较。结果 依据NTM的诊断标准,112例患者最终诊断为NTM肺病78例,MALDI-TOF MS、PCR荧光探针法、BD960法检测NTM的灵敏度分别为:85.9%(67/78)、56.4%(44/78)、28.2%(22/78),MALDI-TOF MS分别与PCR荧光探针、BD960比较,χ^(2)分别为:16.52、52.98,P均<0.05,差异有统计学意义。三种检测技术阳性预计值分别为:98.5%、93.6%、100%,阴性预计值为:75.0%、47.7%、37.8%。MALDI-TOF MS检测诊断NTM肺病时间明显短于液体培养法,差异有统计学意义(Z=8.168,P<0.001)。结论 MALDI-TOF MS检测技术对NTM肺病的诊断具有较高的临床应用价值。

基质辅助激光解析电离-串联飞行时间质谱与电喷雾离子化-四极杆-飞行时间质谱分析蛋白质

为比较基质辅助激光解析电离-串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF)和电喷雾离子化-四极杆-飞行时间质谱(ESI-Q-TOF)在蛋白质定性和定量分析方面的性能,分别利用两种仪器对用于相对和绝对定量的等量异位标签(iTRAQ)标记的雌激素刺激前后MCF7细胞内的蛋白质水解产生的多肽进行了定性和定量分析。结果表明,用MALDI-TOF-TOF和ESI-Q-TOF方法分别鉴定出1086种和848种蛋白质,其中相同的蛋白质为633种;MALDI-TOF-TOF和ESI-Q-TOF方法分别找到38种和33种表达差异在0.5倍以上的蛋白质,其中3种为相同的蛋白质。实验数据说明,两种仪器在蛋白质定性和定量分析方面有很大的互补性,将两种仪器结合使用,不仅能够显著提高蛋白质定性和定量分析的覆盖率,而且可提高分析的置信度。

应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱源后衰变技术鉴定蛋白质

目的 应用源后衰变 (PSD)技术结合数据库检索鉴定二维蛋白质电泳 (2DE)胶上的蛋白质斑点。方法用已知多肽 (ACTH) 1839肽段和TPA被胰酶降解后的 1个肽段建立了PSD MALDI TOF MS方法。结果 应用已建立的PSD MALDI TOF MS法分别将 2DE分离后胶上的 2个未知蛋白质斑点鉴定为 4 0S核糖体蛋白S12和dnaK抑制蛋白。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术在临床微生物检测中的应用

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术可以对临床样本中分离的细菌、真菌等进行快速鉴定。与传统的表型鉴定及分子生物学技术相比,该技术具有高通量、低成本、快速、准确的优势,而且可以直接从血培养、尿等临床标本中鉴定细菌。在细菌的耐药性检测方面也已获得阶段性进展。

利用基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱分析胆囊结石中非黏性蛋白的组成

目的探讨胆固醇结石和胆色素结石中是否存在非黏性蛋白并鉴定蛋白质的组成。方法选取30例行保胆取石术患者的胆囊结石,男性11例,女性19例。采用肉眼观察并结合三酰甘油检测试剂盒(GPO-PAP)测定胆固醇含量的方法对胆结石进行分类,分为20例胆固醇型和10例胆色素型。应用组织裂解法(RIPA)提取胆囊结石蛋白,并用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-TOF)分析相结合的方法对该蛋白进行鉴定分析。通过DAVID工具对上述基因进行基因本体(GO)功能富集分析本图及京都基因、基因组百科全书(KEGG)信号转导通路富集分析。结果胆固醇结石和胆色素结石中出现特异性蛋白,经质谱鉴定为转铁蛋白前体蛋白(TRFE)、白蛋白(ALB)、抗胰蛋白酶1(SERPINA1)、免疫球蛋白γ-1(IGHG1)、α血红蛋白(HBA1)、β血红蛋白(HBB),其中IGHG1不存在于胆色素结石中。结论 TRFE、ALB、SERPINA1、HBA1、HBB等蛋白共同存在于胆固醇和胆色素结石中,而IGHG1只存在于胆固醇结石中,可见IGHG1蛋白或其对应基因是参与不同胆结石类型成因的重要元素及生物标志物。KEGG分析结果表明,SERPINA1参与补体和凝血级联反应。鉴定和分析胆囊结石中非黏性蛋白的成分及利用资料库的模拟对阐明胆囊结石的发病机制有重要的意义。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术在尿标本微生物快速鉴定中的应用

目的评估基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术在尿液标本微生物快速鉴定中的临床应用价值。方法收集苏州大学附属第二医院2016年10-12月住院和门诊送检的中段尿标本进行差速离心沉淀后经MALDI-TOF MS技术检测,同时进行尿常规和有形成分分析,并与传统尿培养鉴定结果进行比较,计算质谱的鉴定率。结果 212例尿培养阳性标本中MALDI-TOF MS技术鉴定出病原菌168例,总鉴定率为79.2%,大肠埃希菌鉴定率最高,为92.0%,其他肠杆菌科细菌、肠球菌属、非发酵菌科鉴定率分别为79.4%、66.5%、66.7%,假丝酵母菌属、链球菌属、其他革兰阳性菌标本量少,鉴定率分别为58.3%、50.0%、44.4%。其中140例标本菌落计数大于105 CFU/mL,鉴定率为92.9%。结论 MALDI-TOF MS技术直接检测尿液标本中的微生物具有简单快速、准确性高等优点,可以弥补传统方法的不足,有效缩短检验时间,优化实验室流程,准确快速地为临床提供检验结果,结合尿常规和有形成分分析等辅助手段具有较高的临床应用价值。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术在病原微生物鉴定中的应用

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)技术最早由田中耕一于1987年提出[1-2],之后逐渐发展并应用于病原微生物的鉴定[3]。MALDI-TOF MS技术凭借其简单快速、高效准确等优点[4],已广泛应用于食品[5]、水产[6]、人类及兽医临床[7-8]等多个领域的病原微生物鉴定工作,在细菌、真菌和病毒鉴定方面,展现了巨大的应用潜力[9]。

基质辅助激光解吸附电离-飞行时间串联质谱研究重组人促红细胞生成素一级结构

建立了生物质谱研究rhEPO一级结构的系列方法,包括分子量、唾液酸含量以及N-糖含量等糖基化性质的测定方法,并用于4种国产rhEPO样品的分析;在此基础上优化酶切条件,使测定的肽质量指纹谱(PMF)的覆盖率均达到98%,成功鉴定了4个样品中的全部N-糖基化位点以及对分子中两对二硫键进行了结构确证,测定4个样品分子量分别为27754.1±27.4Da、27941.4±23.2Da、27682.5±22.0Da和27914.7±22.5Da;唾液酸含量分别为5.0%、4.8%、5.6%和5.4%;糖含量分别为34.3%、34.7%、34.1%和34·6%。此外还对4种产品在O-连接糖型及N-连接糖型上的区别做了初步探讨。

采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱快速检测产KPC大肠埃希菌ST131和ST405分型的研究

目的采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)快速检测产KPC大肠埃希菌ST131、ST405,并对该方法的可行性进行评价。方法收集浙江省人民医院临床分离46株大肠埃希菌,扩增blaKPC耐药基因,采用多位点序列分型方法(MLST)进行分型。MALDI-TOF MS对大肠埃希菌进行鉴定并对不同克隆的峰图进行主成分分析和算法统计,获得分型区分的特征峰。结果 46株KPC型大肠埃希菌均携带KPC-2耐药基因,MLST方法检测到2种ST型,分别为ST131和ST405。主成分分析图显示ST131和ST405可分为2簇,其中2株ST131和3株ST405分类错误。ClinProTools软件4种算法结果基本相似,方法特异度和灵敏度分别为93.27%和97.92%。用于区分ST131和ST405的特征峰主要为8 331.84、4 166.44、4 860.21和2 783.66 Da。这4个峰区分具有统计学意义,有较高准确性。结论采用MALDI-TOF MS可快速区分产KPC大肠埃希菌ST131和ST405,具有操作简单、耗时短、区分灵敏度和特异度高以及成本低等优点,能用于大肠埃希菌克隆分型研究。

应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌对厄他培南的水解能力

目的应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)检测产KPC-2、NDM-1、VIM-2、IMP-1与IMP-4型碳青霉烯酶肠杆菌科细菌水解厄他培南的能力。方法收集2009年6月-2013年12月上海交通大学医学院附属新华医院各种临床标本中分离的耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(CRE),用改良Hodge试验进行产碳青霉烯酶的表型筛选,用PCR扩增方法检测其碳青霉烯酶基因,并经测序确认。应用MALDI-TOF MS进行厄他培南水解预试验以确定最适厄他培南浓度及孵育时间,随后采用预试验中的最适条件,应用MALDI-TOF MS检测CRE水解厄他培南的能力。结果 108株CRE中,有102株改良Hodge试验阳性,其中90株产KPC-2、4株产NDM-1、3株产VIM-2、2株产IMP-1、2株产IMP-4、1株同时产KPC-2和IMP-4型碳青霉烯酶,且在2 h内均能水解厄他培南;另外6株CRE改良Hodge试验阴性,未检测出上述碳青霉烯酶基因,且不水解厄他培南。结论临床微生物实验室应用MALDI-TOF MS能够快速准确检测CRE水解厄他培南的能力,筛查产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌,为临床早期合理使用碳青霉烯类抗生素提供依据。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法测定大蒜寡糖和多糖分子质量分布

研究大蒜多糖的分子质量分布,探索获得适宜于结构研究的不同分子质量分布的大蒜多糖样品的方法。利用不同体积量的丙酮和乙醇为沉淀剂,得到一系列不同分子质量的大蒜多糖样品,并利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)法测定各样品的分子质量分布。结果表明,不同体积量的丙酮与乙醇分解沉淀所获得的样品中都含有低聚糖和多糖,糖的分子质量分布在362～2811u之间;丙酮对大蒜多糖的沉淀能力比乙醇好,3倍体积丙酮的多糖提取液所获得样品中低聚糖的含量高于4倍体积的乙醇。因此,通过调整丙酮或乙醇的的比例可得到不同分子质量分布的大蒜寡糖、多糖。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术检测药物代谢酶基因多态性平台的建立

目的：建立基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术检测患者体内药物代谢酶基因多态性的平台。方法选取2013年10月～2014年6月在北京协和医院门诊就诊患者53例 EDTA抗凝外周血，提取全血基因组DNA，用 MALDI-TOF-MS技术检测53例患者药物代谢酶基因 CYP2C9＊2（rs1799853），CYP2C9＊3（rs1057910）， CYP2C19＊2（rs4244285），CYP2C19＊3（rs4986893），CYP2C19＊4（rs28399504），CYP2C19＊5（rs56337013）和 CYP2C19＊17（rs12248560）的单核苷酸多态性（SNP）位点，并用 Sanger测序法进行验证。结果用 MALDI-TOF-MS 技术可以同时完成53份样本，2个药物代谢酶基因，7个 SNP位点的检测。53例患者中，发现CYP2C19＊2（rs4244285）AG型25例， AA型6例，GG型22例，A等位基因频率为34.9％。CYP2C19＊3（rs4986893）AG型4例，GG型49例，A等位基因频率为3.8％。CYP2C9＊3（rs1057910）CA型5例，AA型48例，C等位基因频率为4.7％。未发现 CYP2C9＊2（rs1799853）， CYP2C19＊4（rs28399504），CYP2C19＊5（rs56337013）和CYP2C19＊17（rs12248560）位点突变。经与 Sanger测序法比较，两种检测方法结果的符合率为100％。结论成功建立 MALDI-TOF-MS技术检测药物代谢酶基因多态性的平台，该平台具有高通量、准确的特点，对个性化用药治疗具有重要的临床应用价值。

应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱和N端测序鉴定重组人粒/巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的结构

目的 :应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 (MALDI -TOF -MS)和N端测序方法鉴定重组人粒 /巨噬细胞集落刺激因子 (rhGM -CSF)的结构。方法 :1 用Edman降解法进行N端测序。 2 应用MALDI-TOF -MS测定分子量并鉴定纯度。 3 通过还原、烷基化确定rhGM -CSF分子中二硫键数目。 4 通过蛋白内切酶Glu -C酶切的肽质量指纹谱确证氨基酸序列并确证其中两对二硫键的配对。结果 :1 测定的rhGM -CSFN端 15个氨基酸序列与从cDNA推导的序列一致。 2 测定的rhGM -CSF分子量与理论计算值一致。 3 证明rhGM -CSF没有自由巯基 ,含有两对二硫键 ,与理论值一致。 4 证明rhGM -CSF的氨基酸序列是正确的 ,并确证其中的两对二硫键配对正确。结论 :确证重组人粒 /巨噬细胞集落刺激因子 (rhGM -CSF)的结构是正确的 ,没有修饰、变异和氨基酸的丢失。应用的方法灵敏、准确。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析技术在微生物检测与鉴定中的应用

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)在微生物检测与鉴定中有着广泛的应用前景。本文着重介绍了MALDI-TOF MS分析技术微生物检测原理、前处理技术及其在微生物检测、鉴定、分型、溯源分析中的应用。与传统的检测鉴定方法相比,MALDI-TOF MS分析技术表现出成本低、检测时间短、易于操作等显著的技术优势。随着微生物质谱数据库以及分析方法的逐渐完善,该技术将成为微生物实验室致病菌快速检测鉴定的重要分析手段。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱快速检测ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌

目的采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)筛选并验证ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌的特异峰,建立快速检测此型别肺炎克雷伯菌的方法。方法收集前期已进行碳青霉烯酶基因检测和多位点序列分型(MLST)的118株肺炎克雷伯菌作为特异峰筛选组,其中ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌67株,非ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌51株,采用Clinpro Tools 3.0软件和Flex analysis 3.0图谱分析软件筛选出ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌的特异峰;再收集前期已进行碳青霉烯酶基因检测和MLST的另外89株肺炎克雷伯菌作为特异峰验证组,严格按照试验条件获得质量图谱,对特异峰的特异性进行验证并进行重复性试验;最后随机收集95株肺炎克雷伯菌临床分离株及其临床鉴定图谱,利用特异峰直接判断菌株是否为ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌,同时对菌株进行碳青霉烯酶基因检测和MLST,以评估特异峰的临床应用价值。结果利用分析软件筛选获得ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌的最佳特异峰为m/z 4 521;在试验条件下,以该峰作为检测此型别细菌的特异峰,其特异性和敏感性分别为98.1%和97.3%,且该特异峰的重复性达97.4%;采用临床鉴定图谱对特异峰的临床应用价值进行评估,其特异性和敏感性分别为95.2%和96.9%。结论 MALDITOF MS可检出ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌的特异峰m/z 4 521。可依据细菌鉴定图谱是否存在此特异峰来直接检测ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌,该特异峰具有较高的特异性和敏感性,可快速、准确地为临床合理、有效的治疗和医院感染的控制提供依据。

溶菌酶基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱分析中的不常见修饰及脱水反应

利用基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)分析了溶菌酶标准蛋白,在常规搜库条件下鉴定到6个独立肽段,Mascot得分420,鉴定覆盖率为54%。此外,经人工解析发现,肽段IVSDG-DGMNAWVAWR(98→112)在样品处理过程中发生了天冬酰胺脱氨化、天冬酰胺脱氨化+甲硫氨酸氧化、天冬酰胺脱氨化+甲硫氨酸氧化+色氨酸氧化等修饰,在激光解吸电离过程中发生脱水反应,脱水位点是脱氨后形成的第103位天冬氨酸。此外,还发现了部分肽段的丙酰胺化修饰。本研究表明,选择一级质谱中的极低丰度离子进行串联质谱分析和利用人工解析方法分析数据库未匹配数据,有可能发现一些特殊的蛋白质修饰,可增加数据利用度和分析结果的确定性。

基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱对临床常见细菌和酵母菌的鉴定能力评价

目的利用基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)和VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定及药敏系统、ATB Expression微生物鉴定及药敏系统鉴定临床常见的细菌和酵母菌,比较鉴定结果的一致性,评价MALDI-TOF MS对临床常见病原菌的鉴定能力。方法连续5 d鉴定123株临床分离株,其中革兰氏阳性菌42株,革兰氏阴性菌71株,酵母菌10株。细菌鉴定同时使用法国梅里埃公司的VITEK MS(采用MALDI-TOF MS技术)和VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定及药敏系统,酵母菌鉴定同时使用VITEK MS和ATB Expression微生物鉴定及药敏系统。将MALDI-TOF MS与传统生物化学方法得到的鉴定结果进行比较,结果不一致的菌株采用16S r RNA测序验证。结果 MALDI-TOF MS与传统生物化学方法得到的鉴定结果相比较,革兰氏阳性菌鉴定符合率为78.6%(33/42),革兰氏阴性菌鉴定符合率为84.5%(60/71),酵母菌鉴定符合率为100.0%(10/10)。其中金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肠球菌及大多数肠杆菌科细菌、非发酵菌的符合率可达95.0%。19株鉴定结果在种的水平上不一致的细菌经16S r RNA测序验证,MALDI-TOF MS的正确率为73.7%,传统生物化学鉴定结果的正确率为49.2%。结论与传统生物化学鉴定手段相比,MALDI-TOF MS对临床常见致病菌具有较好的鉴定能力,鉴定时间显著缩短,可实现临床微生物的快速、准确鉴定。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱在革兰阴性杆菌对β内酰胺类抗生素耐药性检测中的应用进展

β内酰胺类抗生素是一类临床应用最为广泛的抗菌药物,它通过干扰细菌细胞壁肽聚糖的交联结构发挥杀菌作用。该类抗生素包括青霉素及其衍生物、头孢菌素、单酰胺环类和碳青霉烯类等,其中尤以碳青霉烯类抗生素的抗菌活性最强。2013年CHINET细菌耐药性监测数据显示：肠杆菌科细菌对头孢菌素的耐药率约为20%,对碳青霉烯类抗生素的耐药率接近7%;不发酵糖革兰阴性杆菌对头孢菌素和碳青霉烯类抗生素耐药率均接近50%。

基质辅助激光解析飞行时间质谱分析条件及准确度对蛋白质数据库搜索结果的影响

考察了基质辅助激光解析飞行时间质谱获得肽质量指纹谱(PMF)时主要分析条件及准确度对蛋白质数据库搜索结果的影响。将牛血清白蛋白(BSA)经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离、酶解;肽段经质谱分析得PMF数据;用MS-Fit引擎在相同数据库及参数下搜索。得出:(1)激光脉冲击打次数在300次以前时,蛋白序列和肽段覆盖率逐步增加;当击打400次时,覆盖率呈下降趋势;(2)随着激光强度增加,目标蛋白得分、氨基酸序列和肽段的覆盖率逐步增加,但当强度增到1413时,则呈现降低趋势;(3)随延迟时间的增加,肽覆盖率呈递增趋势,但当达260ns后呈下降趋势。按照优化的分析条件对同一位点重复3次,重复性良好。通过对质谱数据准确度的考察,发现以Mix2为外标,数据跟标准值差异越小时,则经其校正后的肽段数据所搜索目标蛋白的得分越高、排序靠前、检出预选蛋白个数越少,可信度越高;反之,难获得候选蛋白。结果表明:质谱准确度和分析条件对蛋白质数据库搜索影响显著。