基质辅助激光解析电离-串联飞行时间质谱与电喷雾离子化-四极杆-飞行时间质谱分析蛋白质

为比较基质辅助激光解析电离-串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF)和电喷雾离子化-四极杆-飞行时间质谱(ESI-Q-TOF)在蛋白质定性和定量分析方面的性能,分别利用两种仪器对用于相对和绝对定量的等量异位标签(iTRAQ)标记的雌激素刺激前后MCF7细胞内的蛋白质水解产生的多肽进行了定性和定量分析。结果表明,用MALDI-TOF-TOF和ESI-Q-TOF方法分别鉴定出1086种和848种蛋白质,其中相同的蛋白质为633种;MALDI-TOF-TOF和ESI-Q-TOF方法分别找到38种和33种表达差异在0.5倍以上的蛋白质,其中3种为相同的蛋白质。实验数据说明,两种仪器在蛋白质定性和定量分析方面有很大的互补性,将两种仪器结合使用,不仅能够显著提高蛋白质定性和定量分析的覆盖率,而且可提高分析的置信度。

基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱法对铜绿假单胞菌的鉴定与聚类分析

目的建立基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱法(matrix assisted laser desorption lonization-time offlight mass spectrometery,MALDI-TOF MS)快速鉴定和聚类分析铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa)。方法将全自动微生物分析仪鉴定为P.aeruginosa的20株分离株和1株标准菌株(CICC 21636)进行MALDI-TOF MS检测。经离线微生物鉴定软件分析,所有菌株均报告为P.aeruginosa。获取21株P.aeruginosa的特征蛋白质指纹图谱,建立命名为Pseudomonas aeruginosa的自建数据库,并采用P.aeruginosa标准菌株CICC 21636进行验证。结果Pseudomonas aeruginosa自建数据库对P.aeruginosa的鉴定结果较设备自带数据库明显提高。而且自建数据库信息基础上,进一步对21株P.aeruginosa进行聚类分型,实现了对不同来源P.aeruginosa可能污染源的追溯。结论作为一种快速、准确、高通量的全新技术手段,MALDI-TOF MS能够实现对P.aeruginosa的特异性快速鉴定,能满足在公共安全卫生、突发食品安全事件和口岸快速通关方面对P.aeruginosa的快速鉴定需求。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测β-内酰胺酶的研究进展

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是一种检测微生物的新型工具,不仅可用于微生物的快速鉴定,而且还可以检测细菌的耐药机制。产β-内酰胺酶是革兰阴性杆菌耐β-内酰胺类抗菌药物的主要耐药机制,目前利用MALDI-TOF MS快速检测细菌β-内酰胺酶的技术已被广泛报道,方法主要有检测β-内酰胺酶水解β-内酰胺类抗菌药物的活性,直接检测β-内酰胺酶分子、肽段或其相关蛋白以及检测β-内酰胺酶基因的单核苷酸多态性等。该文结合最新的研究成果对MALDI-TOF MS在β-内酰胺酶检测中的应用现状进行综述。

基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱法分析人乳β-酪蛋白新生儿体外消化模型多肽组

通过体外模拟新生儿消化道条件,用基质辅助激光解吸离子化飞行时间串联质谱法（MALDI-TOF/TOF）探究人乳β-酪蛋白消化后的多肽组。在离子源加速电压为20 k V,激光波长337 nm,激光频率200 Hz,离子延迟提取时间330 ns,质谱信号单次扫描累加2000次条件下,扫描质量范围m/z 500~5000的肽段。结果表明,消化后得到26个肽段,分子量集中在1000~4000 Da。与已知功能的肽段序列进行对比,人乳β-酪蛋白在新生儿体外模型消化后未产生与已知功能的活性肽序列匹配的肽段,但发现9个肽前体,其中含4个血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽前体,2个酪蛋白磷酸肽（CPP）前体,2个抗氧化肽前体,1个免疫活性肽前体,由酶切位点推测分析,肽前体可以继续在蛋白酶作用下转化为生物活性肽。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法分析天然牦牛酸奶中的德氏乳杆菌

目的探索基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)在牦牛酸奶中德氏乳杆菌检测中的应用。方法采用MALDI-TOF MS对分离自天然牦牛酸奶中的德氏乳杆菌进行分析研究。针对10株分离自牦牛酸奶经16S rDNA鉴定的德氏乳杆菌进行质谱分析,根据乳酸菌的特异性特征,设计6种微生物破碎方法和5种微生物蛋白质抽提方法进行正交组合实验,在同一质谱条件下采用加权计算及均方根误差分析的获得变异较低稳定性高的处理方法。在最佳处理组合下采用SARAMIS Premium对德氏乳杆菌进行相关分析。结果实验结果表明在液氮、超声、甲酸处理下德氏乳杆菌在基质解析电离中可产生稳定且丰富的蛋白质峰组,且相关分析较离散,但实验结果可为菌种差异性分析提供理论帮助。结论 MALDI-TOFMS对天然牦牛酸奶中德氏乳杆菌特征性分析具有较强应用价值。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法对金桔表面细菌的筛查

目的采用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱法对金桔表面细菌进行筛查,初步掌握金桔表面细菌分布情况,为金桔的食用安全提供科学依据。方法以4种常见食源性致病菌(沙门氏菌、阪崎肠杆菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌)为目标菌,同时分离未知菌,通过基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱法进行鉴定。结果共从17个样品中分离到12种细菌,分别为产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、肺炎克雷伯菌、腐生葡萄球菌、木糖葡萄球菌、大肠埃希氏菌、生癌肠杆菌、解鸟氨酸拉乌尔菌、阪崎肠杆菌、分散团菌和恶臭假单胞菌。结论本方法能快速鉴定未知细菌,从金桔上分离到的细菌多数为条件致病菌,存在一定的食用风险。

利用基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱分析胆囊结石中非黏性蛋白的组成

目的探讨胆固醇结石和胆色素结石中是否存在非黏性蛋白并鉴定蛋白质的组成。方法选取30例行保胆取石术患者的胆囊结石,男性11例,女性19例。采用肉眼观察并结合三酰甘油检测试剂盒(GPO-PAP)测定胆固醇含量的方法对胆结石进行分类,分为20例胆固醇型和10例胆色素型。应用组织裂解法(RIPA)提取胆囊结石蛋白,并用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-TOF)分析相结合的方法对该蛋白进行鉴定分析。通过DAVID工具对上述基因进行基因本体(GO)功能富集分析本图及京都基因、基因组百科全书(KEGG)信号转导通路富集分析。结果胆固醇结石和胆色素结石中出现特异性蛋白,经质谱鉴定为转铁蛋白前体蛋白(TRFE)、白蛋白(ALB)、抗胰蛋白酶1(SERPINA1)、免疫球蛋白γ-1(IGHG1)、α血红蛋白(HBA1)、β血红蛋白(HBB),其中IGHG1不存在于胆色素结石中。结论 TRFE、ALB、SERPINA1、HBA1、HBB等蛋白共同存在于胆固醇和胆色素结石中,而IGHG1只存在于胆固醇结石中,可见IGHG1蛋白或其对应基因是参与不同胆结石类型成因的重要元素及生物标志物。KEGG分析结果表明,SERPINA1参与补体和凝血级联反应。鉴定和分析胆囊结石中非黏性蛋白的成分及利用资料库的模拟对阐明胆囊结石的发病机制有重要的意义。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌δ-毒素的应用

目的本研究采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)检测δ-毒素,评估其在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的分型和毒力表达中的作用。方法使用Bruker microflex MALDI-TOF仪器,采集2000~20000Da质量范围内,以正线性模式采集图谱,使用仪器配套的MALDI Biotyper 2.0软件分析MRSA菌株的原始图谱,产生的峰列表直接使用flexAnalysis、clinProTools 3.0软件分析。结果本研究中共检测83株MRSA,共有39(47.0%)株MRSA检出(3005±5)m/z信号峰,其中HA-MRSA19(22.9%)株,CA-MRSA20(26.5%)株,P=0.766,两者之间无显著性差异;33(39.8%)株MRSA检出(3035±5)m/z信号峰,其中HA-MRSA9(10.8%)株,CA-MRSA24(28.9%)株,P=0.003,两者之间有显著性差异;11(13.%)株MRSA既未检出(3005±5)m/z信号峰也未检出(3035±5)m/z信号峰,全部为HA-MRSA菌株。spa分型中检出(3005±5)m/z信号峰,15(18.1%)株为t062型,8株为t015(9.6%)型,4株为t030(4.8%)株,P=0,有显著性差异;检出(3035±5)m/z信号峰,31(37.3%)株为t437型,2(2.4%)株t8660型,P=0,有显著性差异;(3035±5)m/z作为spat437型特征信号ROC曲线下面积0.89,P=0。11株未检出δ-毒素,6株分离自骨关节标本,3株分离自呼吸道标本,1株分离自慢性溃疡的分泌物标本,1株分离自血液;在血平板的菌落特征,6株MRSA菌落形态发生改变,5株菌落形态正常。结论MALDI-TOF MS使用常规方法即可快速检测MRSA的δ-毒素,其质谱峰为(3005±5)m/z和(3035±5)m/z两种;(3035±5)m/z是δ-毒素的同基因变异体(HldG10S)的质谱峰,该峰可快速鉴别spat437型;不产生δ-毒素的菌株是agr调控系统失调的表现,与慢性感染、小菌落形成、无明显β-溶血有关。

基质辅助激光解吸附电离-飞行时间串联质谱研究重组人促红细胞生成素一级结构

建立了生物质谱研究rhEPO一级结构的系列方法,包括分子量、唾液酸含量以及N-糖含量等糖基化性质的测定方法,并用于4种国产rhEPO样品的分析;在此基础上优化酶切条件,使测定的肽质量指纹谱(PMF)的覆盖率均达到98%,成功鉴定了4个样品中的全部N-糖基化位点以及对分子中两对二硫键进行了结构确证,测定4个样品分子量分别为27754.1±27.4Da、27941.4±23.2Da、27682.5±22.0Da和27914.7±22.5Da;唾液酸含量分别为5.0%、4.8%、5.6%和5.4%;糖含量分别为34.3%、34.7%、34.1%和34·6%。此外还对4种产品在O-连接糖型及N-连接糖型上的区别做了初步探讨。

溶菌酶基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱分析中的不常见修饰及脱水反应

利用基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)分析了溶菌酶标准蛋白,在常规搜库条件下鉴定到6个独立肽段,Mascot得分420,鉴定覆盖率为54%。此外,经人工解析发现,肽段IVSDG-DGMNAWVAWR(98→112)在样品处理过程中发生了天冬酰胺脱氨化、天冬酰胺脱氨化+甲硫氨酸氧化、天冬酰胺脱氨化+甲硫氨酸氧化+色氨酸氧化等修饰,在激光解吸电离过程中发生脱水反应,脱水位点是脱氨后形成的第103位天冬氨酸。此外,还发现了部分肽段的丙酰胺化修饰。本研究表明,选择一级质谱中的极低丰度离子进行串联质谱分析和利用人工解析方法分析数据库未匹配数据,有可能发现一些特殊的蛋白质修饰,可增加数据利用度和分析结果的确定性。

基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱鉴定鲨鱼硒结合蛋白

利用基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)高置信度地鉴定了原核表达的白鳍鲨硒结合蛋白。实验表明,硒结合蛋白肽段之一被错误指认为胰酶自水解峰和混合谱是影响其未进行串联质谱分析或不能被数据库搜索匹配的主要原因,同时还发现,虽然赖氨酸结尾肽段在MALDI源中信号强度普遍很低,但对它们进行串联质谱分析也可获得较好的谱图质量,部分数据可用于从头测序。考虑以上因素后,硒结合蛋白鉴定覆盖率由35%增至51%。

谷氨酸甲基化修饰的基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱分析

利用基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)高置信度地鉴定了枯草芽孢杆菌中的蛋白酶抑制剂和杆菌肽F两种蛋白及其翻译后修饰,发现在这两种蛋白质中共有5个肽段发生谷氨酸甲基化,其中肽段FELVVYDSEHK存在FE(Methylation)LVVYDSEHK和FELVVYDSE(Methylation)HK两种形式。结果表明,MALDI-TOF/TOF高能CID所提供的丰富断裂信息和全质量范围扫描对提高分析结果的确定性具有重要作用。此外,这5个甲基化肽段都可以检测到相对含量更高的非甲基化肽段,这为降低分析结果的假阳性提供了辅助判据。在低质量区检测到甲基化赖氨酸的亚胺相关离子m/z 98和143,说明发生了赖氨酸的甲基化;检测到m/z 116则提示发生了谷氨酸甲基化。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法提取阳澄湖全谱图范围内大闸蟹蛋白条件优化

目的建立最佳的蟹肉组织蛋白分析方案,获得最佳基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)图,为基于MALDI-TOF MS技术的阳澄湖大闸蟹产地鉴别分析建立条件。方法从蛋白提取液、基质液以及基质液与提取液配比3个方面对大闸蟹蛋白提取方案进行优化,从激光强度和聚焦质量2个参数对质谱参数进行优化,最终获得最佳的阳澄湖大闸蟹蛋白提取及质谱分析方案。结果通过观察不同条件下的质谱图,最终选择0.1%三氟乙酸进行蛋白提取,芥子酸作为基质液,样品提取液与基质液的上样体积比例选用1:9。而在质谱参数方面,选择9μJ的激光强度和10000 Da的聚焦质量。结论本研究通过比较不同的蛋白提取方法及不同的质谱采集条件,建立最佳的蟹肉组织蛋白分析方案,获得最佳质谱图,为基于MALDI-TOF MS技术的阳澄湖大闸蟹产地鉴别分析建立了条件。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱在病原微生物检测和鉴定中的应用进展

新生儿,尤其是早产儿,机体各组织器官功能尚未成熟,对外界环境的适应能力差,对疾病的抵抗力弱,感染后发病迅速,病死率高[1],因此,快速鉴定感染病原微生物对于新生儿重症监护病房中感染性疾病的防治尤其重要[2]。目前常规病原微生物检测和鉴定主要为传统的分离培养和生理生化方法,这些鉴定方法周期长（35天）,灵敏度和特异性较差,很难满足快速检测与鉴定的需求。虽然近年来使用免疫分析和分子生物学技术,

基质辅助激光解析电离——飞行时间质谱仪的研制及在临床微生物鉴定中的应用

目的探究基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪在临床微生物鉴定中的应用,为真菌微生物的鉴定提供临床技术支持。方法选取于2015年3月到2017年2月我院临床采集的真菌作为实验标本,利用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪对菌种进行鉴定,分析基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪对菌种鉴定的检查效果。结果300株真菌中有290株(96.67%)经鉴定后可以正确归类到种水平,6株(2%)未能给出鉴定成果,4株(1.33%)鉴定结果出现错误,且正确率与传统方法相比差异显著,具有统计学意义(P<0.05)。结论基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪稳定性高,可重复性好,并且具有快速准确的优点,是临床鉴定微生物种类的一种快速可靠的高通量方法,可以为临床的微生物鉴定提供一定的技术支持。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱方法测定全氟烷基磺酸类化合物

以α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid,HCCA)、2,5-二羟基苯甲酸、芥子酸3种常用基质作为基质,分析5种全氟烷基磺酸(全氟丁烷磺酸、全氟己烷磺酸、全氟庚烷磺酸、全氟辛烷磺酸、全氟癸烷磺酸)的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)信号,建立全氟烷基磺酸类化合物的MALDI-TOF MS快速检测方法,初步探究常用基质在负离子反射模式下产生的质谱峰及对待测物的干扰,为全氟烷基磺酸化合物MALDI-TOF MS定量分析及高通量检测方法的建立打下基础。以HCCA作为基质,建立了全氟辛烷磺酸的内标定量检测方法,解决了MALDI-TOF MS检测中定量难的问题。该研究结果表明,采用MALDI-TOF MS内标法测定水中全氟辛烷磺酸的重复性和灵敏度良好,在质量浓度为5~500 ng/mL时,线性相关系数R^(2)为0.9979,检出限为1 ng/mL,定量限为5 ng/mL,水样加标回收率为65%~106%,相对标准偏差为2.36%~17.7%,应用该方法检测水中的全氟辛烷磺酸,能有效实现环境水样中全氟辛烷磺酸的快速定量分析。

羟基硅油的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱表征研究

本文采用吡啶改性的2,5-二羟基苯甲酸作为基质,采用基质辅助激光解吸电离飞行时间技术实现了低聚羟基硅油的质谱表征.通过对一系列羟基硅油样品进行质谱分析,发现聚合物各组分容易缔合钠、钾离子电离,并对不同黏度羟基硅油的数均分子量、重均分子量、多分散性指数,以及羟基含量进行了计算.

串联飞行时间质谱中亚胺离子的断裂特征及其在肽段鉴定中的作用

基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)产生的亚胺离子可以提供丰富的肽段组成信息,该方法通常用于基于数据库搜索的蛋白质鉴定,或者结合化学衍生法用于从头测序,因而在一定程度上限制了对亚胺离子的认识及应用。本研究利用239个串联质谱探索MALDI-TOF/TOF中亚胺离子的断裂特征以及它们在肽段鉴定中的应用,发现在高能碰撞诱导解离条件下组氨酸等14种氨基酸可产生较强的亚胺离子信号(>50%阳性率),氨基酸的化学结构、位置效应和氨基酸残基个数是影响碎片离子强度的主要因素。此外,探讨了亚胺离子应用过程中的假阳性问题,提出亚胺离子相对强度的比较可以降低假阳性和提高肽段鉴定确定度,有助于完善目前的数据库搜索算法和辅助从头测序分析。

基质辅助激光解析-电离-飞行时间质谱法检测单核苷酸多态性的研究进展

单核苷酸多态性(SNP) 是人类基因组中单个碱基的变异和备受关注的第三代多态性遗传标记,其最低基因频率不低于1% ,在复杂疾病、遗传病研究及法医个体识别和亲权鉴定方面都有重要作用.在器官移植和骨髓移植方面,高产量的SNP分析使较大规模、设有较好对照的完整研究得以进行;而通过详细分析移植物预后显著变异性的复杂基因决定因素,则将更有可能获得个体化治疗和改革治疗概念的机会,如细胞因子家族,包括白细胞介素6(IL6)、IL10与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等的基因变异性与器官移植的关系的广泛研究[1].

利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱联合磁珠技术寻找乳腺癌血清蛋白标志物

目的探索乳腺癌与乳腺良性疾病和健康人血清蛋白质谱表达差异,寻找具有鉴别诊断意义的血清蛋白标志物。方法实验分为两大组:(1)决策树模型组共293例标本,包括3个亚组,分别为乳腺癌组110例标本、乳腺良性疾病组113例和健康组70例,建立决策树(乳腺癌诊断)模型;(2)盲法验证组共34例标本,包括3个亚组分别为乳腺癌组7例标本、乳腺良性疾病组13例及健康组14例,进行盲筛验证决策树模型。采用弱阳离子磁珠捕获乳腺癌患者血清中的蛋白,使用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)仪检测绘制蛋白峰。应用Biomarker Wizard TM3.1软件和Biomarker Patterns TM5.0软件分析数据。统计分析采用方差分析法和秩和检验法。计算决策树模型诊断的准确率以及盲法验证模型诊断乳腺癌的敏感性和特异性。结果在决策树模型组中检测到了47个差异有统计学意义的蛋白峰(P<0.050)。应用BPS5.0软件,以相对损失最小的原则从这47个蛋白峰中选取了4个蛋白峰,分别为相对分子质量(Mr,本文中相当于质荷比m/z)9292.5、Mr11707.2、Mr15504.5和Mr16107.9,用其建立决策树模型(乳腺癌诊断模型)。该模型判断乳腺癌、乳腺良性疾病及健康人的准确率分别为99.09%、95.58%、92.86%。盲法验证该模型诊断乳腺癌的敏感性为71.43%,特异性为88.89%。结论应用MALDI-TOF-MS联合磁珠技术可以检测乳腺癌血清中差异蛋白峰并可以建立决策树(乳腺癌诊断)模型。选择的4个差异蛋白蜂建立的决策树模型诊断乳腺癌具有好的准确性和较好的敏感性及特异性。决策树模型能将乳腺癌与乳腺良性疾病及健康人相鉴别。寻找到的Mr9292.54、Mr11707.2、Mr15504.5以及Mr16107.9的蛋白峰有望成为鉴别乳腺癌与乳腺良性疾病和健康人的有效的肿瘤血清蛋白标记物。