塔城病毒Ⅰ型TaqMan探针法荧光定量PCR检测方法的建立

建立快速特异的蜱传塔城病毒Ⅰ型(TcTV-Ⅰ)荧光定量PCR检测方法,用于TcTV-Ⅰ的初步筛查。选用TcTV-Ⅰ糖蛋白G基因设计特异性引物以及TaqMan探针,建立实时荧光定量PCR检测方法。建立的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性,与TcTV-Ⅱ、新布尼来病毒(Severe fever with thrombocytopenia virus,SFTSV)、森林脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus,TBEV)、大别山病毒(Dabieshan orthohanta virus,DBSV)、阿龙山病毒(Alongshan virus,ALSV)等常见蜱传病毒均无交叉反应;标准曲线的循环阈值(Ct值)与模板拷贝数之间呈良好的线性关系,线性相关系数R^(2)=0.9999;具有良好的敏感性,最低检测限为1.10×10^(1)copies/μL,灵敏度是常规PCR的10^(3)倍;具有较好的稳定性,组内和组间的变异系数均低于2%。采用本方法对辽宁、内蒙古及新疆地区的425份蜱样本就行检测,只有新疆地区的19份蜱样本呈阳性。结果表明本研究建立的实时荧光定量PCR方法具有较高的特异性、敏感性和稳定性,可用于TcTV-Ⅰ的快速检测、流行病学调查和疫情监测等。

塔城病毒1重组核蛋白的原核表达和纯化

目的通过原核表达系统表达可溶性塔城病毒1(Tacheng tick virus 1,TcTV-1)重组融合核蛋白(nucleoprotein, NP)并纯化获得纯度高和均一度好的目的蛋白。方法利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)从经密码子优化的重组质粒中扩增TcTV-1核蛋白的编码基因,构建带有小分子泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier, SUMO)融合标签的重组质粒pET-21a-TcTV-1-NP,转化入表达菌株BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG)诱导高表达量菌株。采用镍离子金属鳌合亲和层析介质(Ni-NTA)亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析提纯目的蛋白。结果经PCR扩增的目的基因TcTV-1核蛋白和质粒载体pET-21a进行重组质粒构建,电泳结果显示,在约6 000 bp处可见条带,与重组质粒pET-21a-TcTV-1-NP大小相一致;重组质粒转入大肠埃希菌BL21(DE3),在16℃,0.2 mmol/L IPTG诱导下表达出大量可溶性蛋白,收集并重悬菌体后,经低温高压和超声破碎后,细菌上清液经Ni-NTA亲和层析纯化,在250 mmol/L咪唑洗脱液中获得目的蛋白;去除融合标签后,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)结果显示在相对分子质量为50 000附近处出现明显条带,与目的蛋白相对分子质量为48 800相一致;目的蛋白通过阳离子交换层析,得到1个蛋白洗脱峰;经凝胶过滤层析再次纯化,收集相应的蛋白洗脱峰,经SDS-PAGE结果显示目的蛋白大小正确,纯度较高。结论 TcTV-1重组融合核蛋白在大肠埃希菌内以可溶性形式成功表达,为进一步研究TcTV-1核蛋白的作用机制和相应血清学检测方法的开发提供了重要的基础。

2019-2021年新疆维吾尔自治区蜱与人感染塔城蜱病毒5的监测分析

目的对塔城蜱病毒5(Tacheng Tick Virus 5,TcTV-5)进行检测,为新发蜱媒传染病的监测提供参考。方法2019—2021年采集新疆维吾尔自治区(新疆)6县(市)的寄生蜱和游离蜱451只,对其分别进行形态学和分子生物学鉴定;于2021年收集新疆图木舒克市农牧民血液样本280份,运用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,对收集到的所有样本进行TcTV-5感染阳性率的检测,构建基因进化树,分析遗传进化关系,对检测结果进行分子流行病学分析。结果经形态和分子鉴定,在新疆采集到的蜱分属于3属3种,包括璃眼蜱属的亚洲璃眼蜱、革蜱属的边缘革蜱和扇头蜱属的图兰扇头蜱;新疆蜱与人中均可检测到TcTV-5,6个县(市)的蜱阳性率为3.33%(2/60)~36.11%(26/72),图木舒克市280份人血样本的阳性率为2.50%(7/280)。结论TcTV-5在新疆蜱与人血中均可被检出;在多种蜱种(亚洲璃眼蜱、边缘革蜱、图兰扇头蜱)中均可检测到,边缘革蜱阳性率最高。