新疆塔里木马鹿茸c-myc基因cDNA克隆和bHLHZIP结构分析及表达

采集6头成年马鹿生长60 d茸组织,获得塔里木马鹿茸c-myc基因cDNA全长序列,并比对分析其转录因子的序列特征;结果表明:得到塔里木马鹿茸c-myc基因cDNA 1 840 bp序列,其中ORF区长1 314 bp,编码438个氨基酸;马鹿茸c-myc序列比对,与牛和羊序列相似性最高分别为96%和97%;氨基酸比对分析,在序列121位处马鹿比牛、羊、猪、人类及鼠少1个天冬氨酸(D);马鹿茸c-myc基因的DNA结合域由bHLHZIP结构组成,共80个氨基酸残基,在bHLH区的第16和46位氨基酸处,塔里木马鹿分别为天冬氨酸D和精氨酸R,而牛、羊、猪、人和鼠为天冬酰胺N和赖氨酸L。6个DNA结合位点和E-box的结合位点没有氨基酸变异;羊、牛、猪、人、鼠和马鹿的cmyc基因的Zip序列变异较大。本实验通过0.8 mmol/L IPTG诱导,2 h后构建的Pet-28b-c-myc原核表达载体开始表达目的基因,PAGE检测获得约48 ku目的蛋白质,同时发现随着诱导时间延长没有发现表达量的变化。

塔里木马鹿茸HGF基因部分外显子克隆及表达特征

试验旨在对塔里木马鹿(Cervus elaphus yarkandensis)鹿茸肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)基因进行部分外显子克隆、序列分析及组织表达研究。试验采用改良的Trizol法分别提取茸皮组织、间充质组织、软骨组织、骨组织的总RNA;通过RT-PCR扩增得到HGF基因,回收纯化后,基因与pMD19-T载体连接,转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,鉴定后送测序;利用免疫组化法确定HGF在塔里木马鹿鹿茸顶端组织茸皮、间充质、软骨、骨组织中的表达特征。结果,获得塔里木马鹿茸HGF基因部分外显子大小为349 bp;同源性序列比对结果发现塔里木马鹿HGF与瘤牛、普通牛、白尾鹿、山羊相似性较高;免疫组化试验表明,塔里木马鹿HGF基因在茸皮组织和软骨组织中阳性反应明显,间充质组织和骨组织中阳性反应微弱。本结果为进一步研究HGF基因在塔里木马鹿茸生长中的调控作用提供基础试验数据。

塔里木马鹿鹿茸VEGF基因克隆及其在不同鹿茸组织中的表达研究

试验旨在从塔里木马鹿鹿茸顶端组织中克隆血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的编码序列,分析其分子特性及其在鹿茸组织中的表达情况。本研究采用改良的Trizol法提取鹿茸顶端组织总RNA,以RT-PCR方法获得VEGF基因,回收纯化后连接到pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并鉴定,利用免疫组化法确定VEGF蛋白在塔里木马鹿鹿茸顶端组织茸皮层、间充质层和软骨层中的表达水平。结果显示,VEGF基因开放读码框(ORF)全长为648bp,编码216个氨基酸。通过其序列比对和进化分析发现,塔里木马鹿茸中VEGF与人、牛、羊、猪的VEGF核苷酸序列同源性分别为98.75%、96.55%、97.58%和97.56%,其中与人VEGF同源性较高。免疫组化试验表明,塔里木马鹿VEGF蛋白在间充质、茸皮层和软骨中均有表达,但无明显表达差异。说明塔里木马鹿鹿茸可能会是人类研究再生医学和血管相关疾病的理想模型,同时,本研究为不同发育期塔里木马鹿鹿茸再生干细胞比较蛋白质组学研究提供了基础试验数据。

HGF及其受体c-Met基因在损伤修复的马鹿茸组织中的表达特征

为了探求鹿茸损伤修复的分子机制,本试验收集了意外折断修复50 d和65 d后的鹿茸样品,利用qRT-PCR技术和免疫组织化学技术检测HGF和c-Met基因在损伤修复的鹿茸与健康鹿茸组织中的表达。结果表明,HGF及c-Met基因在损伤茸总组织中的相对表达量显著高于健康鹿茸,在茸皮、间充质、软骨和骨四个组织中,茸皮组织相对表达量最高,间充质组织的相对表达量最低;与健康鹿茸组织相比,损伤茸茸皮组织中HGF及c-Met基因的相对表达量极显著降低(P<0.01),而在损伤茸间充质组织中的相对表达量极显著增加(P<0.01),损伤茸与健康茸的软骨和骨组织相对表达量差异不显著(P>0.05)。在损伤修复过程中,HGF及c-Met基因随损伤修复进程的继续表达量也随之上升。因此,HGF及c-Met基因对马鹿茸组织损伤修复及再发育可能具有促进作用。

小鼠骨髓和鹿茸来源间充质干细胞基本生物学特征比较

为研究塔里木马鹿茸间充质干细胞(MSCs)的生物学特征,本试验对来源于小鼠骨髓和塔里木马鹿茸的2种MSCs进行了体外培养,检测比较了其生长曲线;同时利用光学显微镜和透射电镜对细胞形态特征、结构、细胞器组成和数量进行观察对比。研究发现鹿茸MSCs体外培养呈“S”形生长趋势,增殖速度极显著高于小鼠BMSCs(P<0.01)。鹿茸MSCs形态呈梭形,排列规律,形态均一;小鼠BMSCs形态不规则,呈三角形,多边形;鹿茸MSCs胞体、胞核面积分别为963.053μm^(2)和134.093μm^(2),极显著高于小鼠BMSCs的551.026μm^(2)和79.938μm^(2)(P<0.01);鹿茸MSCs的核质比为0.167,显著低于小鼠BMSCs的0.206(P<0.05);超微结果显示鹿茸MSCs胞体面积较大,细胞器种类简单,线粒体、内质网等细胞器形态具备早期幼稚细胞发育特征。塔里木马鹿茸MSCs增殖能力高于小鼠BMSCs,在开发利用方面具备更广泛的优势。