国内首株猪塞内加谷病毒(Seneca Valley virus)的分离鉴定

猪塞内加谷病毒(Seneca Valley virus,SVV)是一种新出现的可感染仔猪及母猪并导致仔猪死亡的病毒。2015年3月份至今年在我国、巴西及美国出现了几起塞内加谷病毒感染猪群并伴随严重的临床症状及发病死亡的疫情,造成严重的经济损失。为分离鉴定SVV,本研究将RT-PCR检测为SVV阳性的猪临床样品无菌处理后接种PK-15细胞,连续传代培养。通过细胞病变、RT-PCR扩增、电镜观察和基因序列测定对细胞培养物进行鉴定。结果表明我们成功分离到国内首株SVV,并将其命名为SVV CH-01-2015。全基因组的系统发育分析表明SVV CH-01-2015位于Senecavirus病毒属,与Senecavirus病毒属中的病毒成员同源性最高,由此可以确定本研究所分离到的SVV属于Senecavirus病毒属。本研究为进一步研究SVV的致病性和致病机制奠定了基础。

塞内加谷病毒3C蛋白生物信息学分析及真核质粒构建表达

3C蛋白是塞内加谷病毒重要的非结构蛋白之一,在病毒入侵机制及影响宿主抗病毒天然免疫方面发挥重要作用。试验应用Oligo 7.0和Primer 6.0软件,用BLAST对比SVV世界参考株,设计一对特异性引物。以SVV-SN株病毒液抽提RNA为模板,将序列连接pMD19-T载体后测序,对正确片段作生物信息学分析可知SVV 3C可编码一个较稳定非分泌型蛋白,具有一个保守“催化三联体”。预测发现该蛋白具有16个磷酸化位点,证明其较高活性,预测其二级结构后得到再次证实。将pMD19-SVV-3C和真核表达载体pcDNA3.1(+)双酶切后连接,重组质粒经鉴定后命名为pcDNA3.1(+)-SVV-3C。将pcDNA3.1(+)-SVV-3C转染到BHK-21细胞24 h后制样作Western blotting,成功验证该重组质粒可在BHK-21中真核表达。相比其他同科病毒,当前SVV 3C蛋白研究存在空白。文章旨在为进一步研究SVV 3C蛋白结构提供理论依据,为后续探索SVV 3C蛋白对于宿主作用机制奠定基础。

四川地区一株猪塞内加谷病毒的分离鉴定及VP1基因的序列分析

猪塞内加谷病毒(Seneca Valley virus,SVV)是一种新出现的小RNA病毒科病毒,感染该病毒的猪群,尤其是仔猪可能出现严重的病理症状甚至死亡。2015年之前,该病毒主要流行于美国、加拿大及巴西等地区,并于2015年3月传入中国[1],给养猪业带来了严重的经济损失。2018年2月,本实验室检测并收集了阳性病料,采用PK-15细胞对病料进行病毒分离,并通过观察细胞CPE(细胞病变效应)、RT-PCR扩增和VP1基因序列测定进行鉴定。结果显示,成功分离到四川地区第一株SVV并将其命名为CH-MS-2018。对VP1基因的扩增测序及序列分析结果表明,本次分离得到的CH-MS-2018株VP1基因与GenBank上分别于2015年分离的2株和2016年分离的3株美国株的亲缘关系较近,同源性为98.6%。而与最早分离的SVV原始株关系较远,仅为88.0%~89.8%。本研究结果为进一步探索四川地区SVV的生物学性质奠定了基础。

塞内加谷病毒VP1蛋白的表达纯化及鉴定

为表达并纯化塞内加谷病毒(Senecavirus A,SVA)的VP1蛋白,克隆SVA的VP1基因,测定其序列并构建遗传进化树,分析VP1蛋白氨基酸突变位点并预测其二级结构。然后将VP1基因克隆至载体pET-32a(+)中,IPTG诱导表达VP1重组蛋白,用Ni-NTA亲和层析柱纯化并用W estern-blot进行验证。结果显示,表达的VP1重组蛋白的大小为48 ku,主要以包涵体形式存在,能与抗His标签的单克隆抗体发生特异性免疫反应。结果表明成功表达并纯化出VP1重组蛋白。

规模化猪场暴发塞内加谷病及SVV HN16株的分离鉴定

2016年3月,华南某猪场发生水疱性疾病。经实验室PCR诊断,排除FMDV后显示为SVV阳性。使用PK-15细胞进行病毒培养和传代,采用特异性的VP1基因引物扩增该片段,使用DNAMAN7.0和MEGA6.06软件进行同源性分析。结果表明,该病毒可以在细胞上成功繁殖,成功克隆了该病毒的VP1基因,序列长度为694 bp,并进行基因测序和遗传进化分析。序列同源性分析显示:该毒株与国内其他毒株亲缘关系较远,单独形成一个分支。表明该毒株为塞内加谷病毒的新成员,命名为SVV HN16。