塞尼卡病毒A VP1基因遗传进化分析

[目的]研究塞尼卡病毒A VP1基因的遗传变异情况。[方法]通过RT-PCR方法从广东省2个猪场的病料中扩增出塞尼卡病毒A阳性样品,并对其VP1基因进行了基因组扩增和序列分析。[结果]2个塞尼卡病毒A VP1基因与Gen Bank公布的巴西、美国、中国等毒株的同源性为92%99%,与2002年美国分离株SVV-001的同源性分别为92.8%和92.7%,与我国分离株CH-02-2015、CH-03-2015、CH-04-2015的同源性最高达99.1%。通过序列分析发现,毒株VP1基因组存在散在突变点,表明毒株可能存在一定程度的变异。[结论]研究结果可为我国塞尼卡病毒A的深入研究和猪水疱样症状病的鉴别诊断提供参考。

塞尼卡病毒A研究进展

塞尼卡病毒A(SenecavirusA,SVA),原名塞尼卡谷病毒(Senecavalleyvirus,SVV),近年来被证实可引起猪鼻、唇、蹄部等出现水泡性病变,还可造成流行性短暂性新生仔猪损失。该病毒已在美国、加拿大、巴西、中国等地流行,危害养猪业健康发展。本文从SVA的病原特征、疫病流行现状、诊断和防控等方面进行综述,帮助畜牧兽医工作者了解该病毒病。

塞尼卡病毒A在BHK-21细胞中培养条件探索

研究发现,塞尼卡病毒A(Senecavirus A,SVA)是引发猪原发性水疱病(PIVD)的主要原因,感染猪的鼻吻、蹄冠部出现水疱性病变,还可造成新生仔猪死亡。为探索SVA在BHK-21细胞中培养的适宜条件,笔者分别从同步接毒法、单层接毒法、细胞浓度、收毒时间、血清含量等方面设计试验开展研究。本试验结果为制备高效价的SVA抗原提供了数据资料。

塞尼卡病毒与口蹄疫病毒双重RT-PCR鉴别检测方法的建立

2014~2015年,美国、巴西等国爆发了一种症状类似于口蹄疫的水泡性疾病,病原被确定为塞尼卡病毒A(Senecavirus A,SVA)。为了鉴别和诊断塞尼卡病毒A和口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV),本研究针对塞尼卡病毒的VP1基因和口蹄疫的5’UTR基因,合成特异性引物,优化了反应体系和扩增条件,建立了一种可同时检测塞尼卡病毒A和口蹄疫病毒的双重RT-PCR方法。特异性和敏感性试验结果表明,建立的双重RT-PCR检测方法特异性好,敏感性强,对塞尼卡病毒A和口蹄疫病毒最低检出量分别为104 copies/μL、103 copies/μL。本研究建立的方法对临床快速鉴别塞尼卡病毒A和口蹄疫病毒感染具有重要意义。

塞尼卡谷病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、灵敏的塞尼卡谷病毒(SVV)检测方法,本研究针对病毒基因保守区域设计了一对引物和探针,并优化反应条件,建立了检测SVV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果表明,以重组质粒为标准品建立的标准曲线在2.8×107拷贝/μL^2.8×10~1拷贝/μL范围内具有良好的线性关系;该方法与口蹄疫、猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎病毒均无交叉反应;检测灵敏度可达2.8拷贝/μL,灵敏度高于普通PCR;批内和批间的变异系数为1.73%~4.00%,具有良好的稳定性。本研究建立的TaqMan荧光定量PCR方法可以用于SVV的检测,还可以作为诊断技术储备,应对我国未来可能出现流行的猪原发性疱疹病。

塞尼卡谷病毒重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条检测方法的建立

为建立塞尼卡谷病毒(SVV)重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测方法,本研究针对SVV 3D基因设计了引物和探针,通过反应条件优化、特异性、灵敏性和重复性试验,建立了SVV RPA-LFD检测方法。特异性试验结果显示,该方法与口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、圆环病毒、伪狂犬病毒无交叉反应;在40℃、20 min内可检测的最低浓度为56拷贝/μL质粒标准品;通过3次重复试验检测,LFD检测线灰度值变异系数范围在4.49%~9.73%。利用该方法对120份国内临床样品进行检测,结果均为阴性。本研究首次建立了检测SVV的等温、快速RPA-LFD方法,读取结果不依赖任何仪器设备,为猪群感染SVV的现场快速诊断、流行病学研究和根除方案的制定提供帮助。

健康猪体内塞尼卡病毒的分离和鉴定

塞尼卡病毒(SVA)属于小核糖RNA病毒科塞尼卡病毒属,可以引起猪的水泡样病变、跛行和新生仔猪突然死亡等。为了解SVA的特性,本研究将从健康猪体内鉴定的SVA阳性样品接种BHK-21细胞分离SVA,采用PCR扩增其VP1基因,并分析其遗传变异特点。结果显示,10份SVA阳性样品中有2份(GXT91和GXT94)能够在BHK-21细胞增殖并产生明显的细胞病变,可达10^7.6TCID50/mL,其VP1基因与SVA参考株NC_011349的核酸同源性为90.2%~90.6%,推导氨基酸同源性为96.7%~97.1%,进化树显示新分离的GXT91和GXT94病毒株属于流行分支II。本研究为SVA的疫苗研制奠定了基础。

塞尼卡谷病毒重组酶聚合酶扩增技术(RPA)实时荧光检测方法的建立

塞尼卡谷病毒(Seneca valley virus,SVV)可感染猪,引起类似口蹄疫病毒感染造成的水疱性病变,新生仔猪病死率达30%~70%。本研究利用重组酶聚合酶扩增技术(RPA),针对SVV 3D基因设计了引物和探针,并进行筛选、反应条件优化以及敏感性、特异性和重复性试验,建立了实时荧光RPA方法。结果显示,本方法在40℃、10 min内检测的最低浓度为28拷贝/μL;与口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒无交叉反应;通过3次重复试验检测2.8×10~6~2.8×10~1拷贝/μL的6个稀释度样品,在荧光强度达1500 mV所需时间变异系数范围在2.44%~14.95%。该等温、快速扩增方法为猪群出现水疱性疾病的鉴别诊断提供了技术支持,对及时采取适当防控措施具有重要意义。

基于TaqMan探针的A型塞尼卡病毒荧光定量RT-PCR方法的建立及应用

为建立一种快速、特异、灵敏的A型塞尼卡病毒(SVA)检测方法,通过比对我国不同地区SVA流行毒株的VP1基因序列,在其保守区域设计了1组引物和探针,通过条件优化,建立了基于TaqMan探针的荧光定量RT-PCR检测方法。用该方法检测口蹄疫病毒、猪瘟病毒、日本脑炎病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒等均不发生交叉反应。敏感性分析显示,该方法的最低检出量为278拷贝/μL,比常规RT-PCR的灵敏度高100倍。重复性分析显示,所建立方法的批内变异系数为0.3%~1.0%,批间变异系数为0.8%~2.0%,具有良好的稳定性。进一步对16份疑似SVA感染的临床病料检进行了检测,结果显示8份为SVA核酸阳性。提示建立的检测方法可以用于临床SVA感染的鉴别诊断,为我国SVA的诊断和控制提供了良好的技术支撑。

猪塞尼卡谷病毒病现状与未来防控思考

最近研究发现,塞尼卡谷病毒(SVV)是引起猪原发性水疱病(PIVD)的主要原因,可导致感染猪的鼻吻、蹄冠部出现水疱性病变,新生仔猪死亡。近年来,猪塞尼卡谷病毒病陆续波及加拿大、美国、巴西、中国、泰国和哥伦比亚等国,值得高度关注。本文介绍了猪塞尼卡谷病毒病的发现、流行现状及临床表现。提示我国应重视该病的防控工作,具体措施包括:建立健全动物水疱性疫病诊断处置方案;做好追溯研究,加强主动监测;分析病毒基因分子进化规律,关注SVV演变;继续进行病毒致病机制及宿主抗感染免疫机制等基础研究;制定SVV诊断国家标准,同时开发快速、灵敏、方便的现场诊断方法及高通量鉴别诊断方法;研制新型安全有效的SVV疫苗;加强饲养管理,提高生物安全水平。

猪塞尼卡谷病毒单克隆抗体的制备及鉴定

【目的】纯化猪塞尼卡谷病毒(Seneca Valley virus,SVV)SVV-CH-HB2016毒株,并制备其结构蛋白VP1、VP2和VP3的单克隆抗体。【方法】以蔗糖密度梯度离心法纯化的SVV-CH-HB2016病毒颗粒作为抗原,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行细胞融合。通过间接免疫荧光试验(IFA)结合间接ELISA筛选阳性细胞株,制备能特异性分泌针对结构蛋白的杂交瘤细胞株。采用Western blotting和IFA方法分别检测单克隆抗体与重组表达蛋白及天然结构蛋白的反应性,并对单克隆抗体的病毒中和保护效果进行测定。利用空斑试验和实时荧光定量PCR方法探究中和性单克隆抗体对SVV-CH-HB2016毒株吸附过程的影响,最后用抗体相加试验来分析14株单克隆抗体的抗原表位。【结果】在蔗糖密度梯度为5%~45%(W/V)时获得了纯度较好、浓度较高的SVV-CH-HB2016毒株结构蛋白,免疫小鼠血清抗体效价均达到了1∶12800,成功制备了17株能稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经验证14株单克隆抗体能与重组结构蛋白发生Western blotting反应,17株单克隆抗体能与病毒发生IFA作用;2G6、4A3和4C113株单克隆抗体对SVV-CH-HB2016毒株感染的BHK-21细胞具有明显中和保护作用,也能有效抑制SVV-CH-HB2016毒株对293T细胞的吸附。经分析发现,除1F5与2E1、4B8与4F11外,其余10株单克隆抗体分别针对不同抗原表位。【结论】本研究初步建立了SVV的纯化方法,制备了17株特异性针对SVV-CH-HB2016毒株的单克隆抗体,为后期进一步开展SVV全病毒灭活疫苗的研发、ELISA检测方法的建立及保护性抗原表位的鉴定奠定了基础。

猪塞尼卡谷病毒病灭活疫苗免疫持续期测定

旨在研究猪塞尼卡谷病毒病灭活疫苗的免疫持续期。将两批实验室制品颈部肌肉注射2~3月龄健康猪,2.0 mL/头,免疫后21 d加强免疫1次,首次免疫后7、14、21、28、35、50、80、110、140、170、200 d分别采血,测定塞尼卡谷病毒(SVV)中和抗体效价,并于170 d和200 d分别随机抽取5头猪进行攻毒,以攻毒保护率均高于80%的最长免疫时间确定为疫苗的免疫持续期。免疫时间从第一次免疫后开始计算。结果显示,两批实验室制品免疫后7 d血清SVV中和抗体效价平均达1∶10以上;免疫后21 d中和抗体平均达1∶82.5以上;免疫后50 d血清抗体达到顶峰,中和抗体平均达1∶938.4以上。之后抗体呈下降趋势。免疫后170 d中和抗体平均达1∶192.1以上,免疫后200 d中和抗体平均达1∶73.8以上。免疫后170和200 d攻毒,保护率均达100%。试验结果说明,猪塞尼卡谷病毒灭活疫苗免疫期至少可维持到200 d,具有重要研发前景。

塞尼卡谷病毒3ABC蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

为了开发塞尼卡谷病毒(Seneca Valley virus,SVV)的检测试剂盒,克隆3 ABC基因进行原核表达和纯化,并将纯化的3ABC蛋白免疫大鼠,制备抗3ABC蛋白的多克隆抗体。通过Western blot鉴定制备的多克隆抗体与表达的3ABC蛋白的特异性识别能力,通过ELISA测定多克隆抗体的效价。结果显示,3 ABC基因在大肠杆菌中大量表达,且主要以包涵体形式表达,重组蛋白分子质量约为55 ku,经纯化后得到单一条带。免疫大鼠制备的多克隆抗体效价大于1∶64000,且与表达的3ABC重组蛋白发生特异性反应。综上,在大肠杆菌中成功表达了SVV 3ABC蛋白,且表达的重组蛋白具有免疫原性。

一例塞尼卡谷病毒的诊断及防控

2018年2月广东某存栏1 000头母猪的自繁自养猪场发生疑似口蹄疫(FMD)病例,临床表现为部分母猪及哺乳仔猪的鼻子和冠状带出现水疱、跛行、厌食、发烧等症状。采集病料进行实验室RT-PCR检测,结果为O、A、亚洲1型口蹄疫抗原阴性,塞尼卡谷病毒抗原阳性,确诊该病例为塞尼卡谷病毒感染。

猪塞尼卡病毒诊断分析与防控

在猪养殖业中经常发生水疱病,多数人认为该疾病主要由口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、猪传染性水疱疹病毒、猪水疱病病毒引起。但是在2007年加拿大发生猪原发性水疱病以来,随后美国和巴西也暴发该疾病,经过检测没有发现以上4种病毒,认为与塞尼卡病毒A有密切的关系,在我国广东的族群中也发现了该病毒,此后,在我国的华中华南福建等地区也发生该疫情,说明该病毒已呈现区域性分布的特点,应该引起高度重视。本文主要阐述了猪塞尼卡病毒的特点、流行病学、临床症状、诊断和防控措施。

猪塞尼卡谷病毒诊断方法的研究进展

塞尼卡谷病毒(SVV)主要引起猪水泡等临床症状,与口蹄疫、水泡性口炎、猪水泡病等临床症状相似.自2015年美国猪场发生猪塞尼卡谷以后,包括我国在内的多个国家相继爆发了该病,给猪场带来巨大的经济损失.因此,开发有效的诊断方法对于SVV的诊断、防控和净化显得尤为重要.目前关于SVV的诊断方法也有较多报道,本文旨在对前期文献进行综述,以期为后续开发系统、灵敏、高效、快捷的SVV诊断方法给提供铺垫.

一例疑似猪塞尼卡谷病毒感染病例的确诊和分析

猪塞尼卡谷病毒病是一种由塞尼卡谷病毒(seneca vally virus,SVV)感染引起的猪原发性水泡病。患病猪临床表现为口鼻黏膜、蹄部出现水疱和溃疡,同时伴有跛行、厌食、嗜睡和发热等。广东省某自繁自养猪场部分猪只的鼻吻、蹄部冠状带发生水泡病变,为确定病因以制定行之有效的防治措施,对采集的病料进行SVV VP1基因扩增及分析。结果显示,6份水泡样品中均扩增出545 bp目的条带,扩增产物CH/GD/1808与美国USA/IN Purdue 3698/2016毒株VP1基因同源性为98.3%,遗传进化密切相关;与美国分离株USA/GBI26/2015、中国分离株SVA-OH2、pKS15-01核苷酸同源性最高,为98.8%;确诊患病猪感染塞尼卡谷病毒。

猪塞尼卡谷病毒的诊断及预防治疗

塞尼卡谷病毒病又被称为原发性水疱、原发性疱疹病,在猪生产上造成了严重的危害和影响,它是由RNA病毒引起的猪传染的一种病毒性疾病,该病的主要发病部位在猪口腔、鼻吻部、蹄部等位置,会出现水疱性病变等临床症状,在生产上容易与猪口蹄疫病毒、水疱病毒、水胞疹等各类病相混淆,由于其临床症状相似,难以区分,因此常常耗费了更多的精力和成本用以治疗。本文主要从该病毒的流行病学、临床症状、诊断方法以及综合防治措施等几个方面进行综述,希望对养猪业的人员提供帮助,做出参考意见。

豫北塞尼卡谷病毒VP1基因的扩增和序列分析

塞尼卡谷病毒(Seneca Valley virus,SVV)是一种新发的猪病毒病,在我国猪群中已形成一定的流行性。本文首先对豫北一猪场发生水泡症状的猪进行病料采集,然后提取病毒RNA,通过反转录和PCR扩增到SVV的VP1基因,并对其进行测序。通过MegAlign软件对VP1基因序列进行遗传进化分析,利用在线生物信息学软件预测VP1蛋白的信号肽、核定位信号和B细胞表位。结果表明:豫北毒株与一株美国毒株USA-IA44952(登录号为KU954090.1)的核苷酸同源性最高,与SVV-001毒株核苷酸同源性最低(登录号为DQ641257.1),VP1蛋白没有信号肽序列,没有核定位信号,有8个B细胞线性抗原表位。

猪塞尼卡病毒TaqMan探针荧光RT-PCR方法的建立和应用

塞尼卡病毒(Senecavirus A,SVA)为小核糖RNA病毒科塞尼卡病毒属的单股正链RNA病毒,可引起猪的水泡样病变、跛行和新生仔猪突然死亡等,我国已经有多个省市检测到了本病毒。为建立一种快速高效、适应范围广的SVA检测方法,本研究以分离到的1株SVA流行病毒株GXT91作为参考毒株,设计合成了TaqMan探针和1对引物建立了SVA的荧光RT-PCR方法,并分别进行该方法的敏感性、特异性和重复性试验。结果显示:该方法的敏感性达到了17.4个分子拷贝/μL,与口蹄疫病毒、猪瘟病毒等病原无交叉反应,表明它具有较高的特异性,组间和组内重复性试验的变异系数均小于2%,表明其重复性较好。进一步运用该方法对48份临床样本进行检测,从中发现了12份阳性样品。这表明本研究建立的荧光RT-PCR是一种良好的诊断SVA的方法,可用于待测样本中SVA的诊断和流行病学调查监测等。