基于COL1A1启动子和增强型绿色荧光蛋白基因建立人肝星状细胞活化的细胞模型

目的:建立评价人肝星状细胞中Ⅰ型胶原蛋白Ⅰα1肽链(collagen Iα1 chain,COL1A1)基因启动子活性的可视化报告系统,判断细胞的活化状态,为抗肝纤维化药物的研究提供细胞模型。方法:以人肝癌细胞株HepG2基因组DNA为模板,扩增COL1A1启动子序列。在pLVX-AcGFP1-N1质粒基础上构建以COL1A1启动子调控增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因表达的重组质粒pLVX-COL1A1-EGFP。使用慢病毒包装系统将pLVX-COL1A1-EGFP稳定转染至永生化的人肝星状细胞LX-2中,并筛选单克隆细胞株。对该细胞株使用转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)激活及2种具有潜在抗肝纤维化作用的药物处理。使用荧光显微镜及ImageJ 1.49软件对细胞中EGFP荧光强度进行半定量分析,再分别使用逆转录实时定量PCR(reverse transcription real-time quantitative PCR,RT-qPCR)和免疫印迹试验检测胞内COL1A1和EGFP的mRNA水平与蛋白质水平。结果:构建了由COL1A1启动子调控EGFP表达的重组慢病毒质粒pLVX-COL1A1-EGFP,并加入了Kozak序列以增强EGFP的表达,获得了稳定转染pLVX-COL1A1-EGFP的LX-2单克隆细胞株LX-2-CE。LX-2-CE经过TGF-β1和具有潜在抗肝纤维化作用的5μmol/L二氢丹参酮Ⅰ共处理24 h后,其总荧光强度和平均荧光强度均低于TGF-β1单处理组(P<0.05);胞内COL1A1和EGFP的mRNA水平与蛋白质水平同样均低于TGF-β1单处理组(P<0.05)。结论:成功构建了基于COL1A1启动子调控EGFP表达的肝星状细胞活化的报告系统,可在体外直观报告肝星状细胞活化相关标志物COL1A1表达,为抗肝纤维化药物的筛选和研究提供了新的细胞模型。

腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因在大鼠成体肝干细胞中的表达

目的:研究腺病毒感染成体肝干细胞介导外源基因表达的可行性及建立稳定表达EGFP的成体肝干细胞.方法:采用细菌同源重组法构建CMV驱动的EGFP报告基因腺病毒载体pAd-CMV-EGFP,在293细胞中包装制备腺病毒,并用重组腺病毒感染体外培养的成体肝干细胞WB-F344,观察腺病毒携带的外源基因EGFP在WB-F344细胞中的表达,及分析病毒对肝干细胞的感染效率.进一步单克隆培养纯化建立稳定表达EGFP的细胞株(WB-EGFP),并采用流式细胞技术、免疫细胞化学技术、诱导分化实验以观察其生物学特性.结果:成功构建腺病毒载体,并包装制备高滴度的重组腺病毒Ad-EGFP.重组腺病毒有效的感染WB-F344细胞,感染率约40-70%.建立WB-EGFP细胞株,持续传代8-9代均较稳定表达EGFP及肝干细胞表面标记,仍保持干细胞样的增生、分化等基本生物学特性.结论:腺病毒可高水平的介导外源基因表达于成体肝干细胞,是有效的基因转移系统.稳定表达EGFP的肝干细胞株观察直观、可连续传代,并保持干细胞的生物学特性,可用于体内外肝细胞研究中的追踪、鉴定.

脂质体介导增强型绿色荧光蛋白基因在鼠视网膜Müller细胞中的表达

目的研究脂质体介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因对体外培养的鼠视网膜Müller细胞转染的有效性及安全性。方法采用视网膜组织块法培养鼠视网膜Müller细胞,振荡法分离纯化细胞,并对其进行免疫细胞化学鉴定。用阳离子脂质体Lipofectamine 2000负载pEGFP-N1质粒转染Müller细胞,荧光显微镜检测转染后12、24、48、72h的转染效率。台盼蓝排斥实验检测转染和未转染细胞的活力,明确脂质体Lipofectamine 2000对Müller细胞的毒性作用。结果成功培养视网膜Müller细胞,传代后90%以上的细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色阳性。Lipofectamine 2000介导质粒pEGFP-N1转染Müller细胞后12、24、48、72h的转染效率分别为(9.7±1.9)%、(18.1±16)%、(17.2±2.5)%、(16.9±1.7)%。台盼蓝排斥实验显示Lipofectamine 2000转染前后活细胞率分别为(98.2±5.6)%、(96.1±6.2)%。结论脂质体Lipofectamine 2000可安全有效地介导Müller细胞的转染,为进一步明确Müller细胞的病理、生理功能及靶向Müller细胞的基因治疗提供了新的手段。

增强型绿色荧光蛋白基因在日本血吸虫成虫体内的瞬时表达

目的探讨异源性增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因在日本血吸虫成虫体内表达的可能性。方法运用电穿孔技术将质粒pEGFP-C1导入日本血吸虫成虫体内,提取分离体外培养48小时成虫的基因组DNA、总RNA和全虫蛋白,分别用PCR、RT-PCR和Western blot验证转基因在成虫体内的存在、转录和翻译。同时,使用激光共聚焦扫描显微镜对EGFP在成虫体内进行定位。结果PCR和RT-PCR分别成功的扩增出760bp和276bp的预期大小的片断,Western-blot证实了EGFP基因在成虫体内的表达;激光共聚焦显微镜观察到,EGFP主要定位在成虫的皮层,口吸盘和尾部尤为明显。结论电穿孔技术成功地将异源基因引入日本血吸虫成虫体内并获得表达,为转基因血吸虫和基因功能的研究打下基础。

增强型绿色荧光蛋白基因真核表达载体的构建

构建增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)基因的真核表达载体pCDNA3.1(+) EGFP,转染至培养的Hela细胞中成功表达,并发出绿色荧光,证明EGFP一种良好的报告基因和筛选标记.

重组腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染兔骨髓间充质干细胞

背景:目前仍没有合适的标记方法追踪观察兔骨髓间充质干细胞组织修复及基因治疗的效果。目的:观察重组腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因在兔骨髓间充质干细胞中的表达,及转染后干细胞活性的变化,以寻找稳定标记兔骨髓间充质干细胞的方法。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/05在南京市第一医院骨科干细胞实验室完成。材料:健康2月龄纯种新西兰大白兔4只,由南京医科大学实验动物基地提供。重组腺病毒Ad5/F35-EGFP为北京本元正阳基因有限公司产品。方法:用密度梯度离心法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,贴壁法纯化扩增。取传至第4代细胞,流式细胞仪检测细胞标志的表达,消化离心重悬后进行计数,平均分成5组,每组细胞数5.0×105个,接种于25m2培养瓶,空白组加入50μL的PBS液,剩余4组加入重组腺病毒Ad5/F35-EGFP进行转染,感染复数(MOI)分别为10,20,50,100,继续传代培养。主要观察指标:骨髓间充质干细胞的生长状态及表面标志鉴定,转染后骨髓间充质干细胞增强型绿色荧光蛋白的表达及活性变化。结果:原代培养48h后见细胞贴壁,8d时细胞铺满瓶底80%以上,绝大多数呈梭形,传代后细胞增殖速度加快,三四天即可传代,第4代细胞CD29和CD44呈阳性表达,CD34与CD45呈阴性表达。转染后24h可见绿色荧光,7d时荧光最强,细胞转染率与感染复数值的呈线性增长关系,至49d时仍可见绿色荧光。转染后0,7,14,28,49d,感染复数=50组的骨髓间充质干细胞数量均与空白组基本相似(P均>0.05),即转染后细胞增殖能力无明显变化。结论:重组腺病毒载体能高效标记骨髓间充质干细胞,感染复数为50时较为理想,增强型绿色荧光蛋白基因可持续表达49d,且标记后不影响骨髓间充质干细胞的增殖活性。

突变型人APP基因与增强型绿色荧光蛋白基因融合载体的构建

目的构建携带突变型人淀粉样前体蛋白基因(APP695)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合载体。方法在NCBI上查找APP695的序列,设计引物。以pCB6质粒携带的野生型APP695序列为模板,以突变体引物扩增突变型APP695。将突变型APP695与pIRES2-EGFP连接并测序证实。结果经过酶切鉴定、PCR和DNA测序等方法,证实构建的pIRES2-EGFP/APP695突变型质粒载体序列正确。结论成功构建APP695-EGFP融合基因载体,为研究AD发病的分子机制和治疗时的药物筛选奠定基础。

腺相关病毒-1介导增强型绿色荧光蛋白基因在大鼠角膜基质细胞体内外转染的研究

目的：探讨血清1型腺相关病毒（rAAV1）介导增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因体内、外转染大鼠角膜基质细胞后绿色荧光蛋白（GFP）的表达及转染率。方法：采用携带绿色荧光蛋白报告基因的血清1型腺相关病毒（rAAV1-EGFP）感染原代培养的SD大鼠角膜基质细胞，通过荧光显微镜和流式细胞仪观察和检测EGFP的表达及阳性率。建立大鼠异体角膜移植模型，用含rAAV1-EGFP转染液的培养基在37℃孵育SD大鼠角膜植片同时浸泡缝线18h，再用此缝线间断缝合，将植片移植到大鼠角膜植床，术后通过荧光体视镜观察Wistar大鼠角膜出现EGFP荧光的起始时间及分布情况。结果：按rAAV1-EGFP不同转染倍数（MOI）转染角膜基质细胞。转染后3d，在倒置荧光显微镜下观察到角膜基质细胞的细胞质有GFP阳性表达。体视荧光显微镜观察到大鼠角膜中开始有GFP阳性表达；随MOI值的增高而增强，转染再7～9d达到高峰，此时检测rAAV1-EGFP对角膜基质细胞的转染效率，MOI=10^时是16．3％，MOI=10^4时是30．3％，MOI=10^5时是43．6％，MOI=10^6时是47．5％.rAA1－ECFP在大鼠角膜中的表达也明显增强。结论：rAAV1-ECFP可以在体内外稳定、有转染大鼠角膜基质细胞，是角膜基质细胞理想的报告基因。

逆转录病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的:观察逆转录病毒介导绿色荧光蛋白基因在SD大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)中的表达,为干细胞移植机制的研究提供基础.方法:采用密度梯度离心法分离培养BMSCs,诱导培养液诱导其向成脂肪方向分化,行细胞表面抗原鉴定,及油红O染色评价细胞成脂肪情况.在此基础上,采用逆转录病毒pLEGFP-N1对细胞进行荧光蛋白标记.观察细胞形态学改变荧光表达的时间与强度,计算转染率.结果:细胞扩增迅速,形态良好,纯度较高,经诱导后细胞内可见脂滴.逆转录病毒载体pLEGFP-N1成功标记SD大鼠骨髓间充质干细胞,并对4 wk体外培养进行了良好的标记.结论:逆转录病毒pLEGFP-N1转染效率高,转染成功的BMSCs可以长期稳定表达目的基因,是一种理想的病毒载体.

增强型绿色荧光蛋白基因转染小鼠骨髓间充质干细胞的研究

目的:以重组腺病毒(Ad)为载体,将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染至小鼠骨髓间充质干细胞(mMSCs)中,为MSCs体内示踪提供实验基础。方法:用全骨髓细胞贴壁法分离纯化小鼠MSCs并体外扩增、鉴定,以重组绿色荧光蛋白基因的腺病毒(Ad-EGFP)转染,并用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染率,CCK-8法检测转染细胞的增殖活性。结果:转染后10h MSCs开始表达荧光,6～8天达高峰,转染率可达92.3%,28天仍有表达;转染细胞的增殖活性和未转染细胞无统计学差异。结论:Ad-EGFP能高效、安全的转染mMSCs。

1型重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染人脐静脉内皮细胞的体外研究

目的评价1型重组腺相关病毒(rAAV1)作为新生血管性角膜病变基因治疗载体的可行性。方法rAAV1-EGFP按转染倍数(MOI)5×103,5×104,5×105转染ECV304细胞,转染后在倒置荧光显微镜下观察ECV304细胞中GFP阳性表达情况和细胞生长形态特点等,流式细胞仪检测rAAV1-EGFP对EVE304细胞的转染效率。MTT法检测rAAV1-EGFP对EVC304细胞增殖的影响。结果转染后2d,MOI=5×105组细胞中的GFP开始表达;表达强度随MOI值的增高而增强,同时GFP的表达强度随着时间延长而逐渐增强,转染后第7天达到高峰,此时流式细胞仪检测rAAV1-EGFP对ECV304细胞的转染率分别为45.90%(MOI=5×103),58.56%(MOI=5×104),68.31%(MOI=5×105)。AAV1-EGFP转染ECV304细胞后,细胞生长及形态正常,MTT法显示转染后72、96h各转染组与未转染组之间A值无显著性差异。结论rAAV1-EGFP对ECV304细胞转染稳定、有效,重组腺相关病毒对细胞增殖无明显抑制,重组腺相关病毒可作为基因治疗角膜新生血管性病变的载体。

增强型绿色荧光蛋白基因电穿孔转染骨髓间充质干细胞的研究

目的 建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养方法, 探讨电穿孔法介导外源基因转染骨髓间充质干细胞的可行性及转染效率。方法 Ficoll PaqueTMPlus淋巴细胞分离液分离大鼠骨髓间充质干细胞 (rMSCs) 并进行原代培养和传代扩增, 免疫组化的方法对其初步鉴定。用荧光显微镜、细胞计数法和流式细胞仪分析转染效率。结果 电穿孔法可较高效转染 rMSCs, 转染率为 (32. 8%±3)%。该条件下电转染后的MSCs其生长曲线与转染前的细胞比较无明显变化。结论 优化条件的电穿孔法具有较高的介导外源基因表达于 rMSCs的效率, 且对 rMSCs的生物学行为没有明显影响。

慢病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因修饰人骨髓基质细胞

背景:原代细胞的转染效率低下一直是制约其发展的主要因素之一,慢病毒转染以其独特的优势成为各种干细胞基因修饰良好的转染方法。目的:验证慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白基因修饰人骨髓基质细胞的可行性。方法:将携带增强型绿色荧光蛋白基因的慢病毒在含血清或无血清条件下按不同的MOI值分别转染人骨髓基质细胞,长期观察荧光蛋白表达情况。将经修饰的细胞通过立体定向移植入大鼠纹状体内,观察移植细胞的存活及目的基因的表达情况。结果与结论:基因转染48h后,可见人骨髓基质细胞成功表达绿色荧光蛋白,无血清条件下的转染效率高于含血清条件下的转染效率,转染成功的细胞在体外持续培养2个月以上未见明显的荧光消减。转染后的细胞可在大鼠纹状体存活并持续表达绿色荧光蛋白2个月以上。提示慢病毒是一种高效的转染人骨髓基质细胞的载体,慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白基因转染可以作为人骨髓基质细胞的示踪标志用于体内移植研究。

小鼠胚胎神经干细胞的体外培养及增强型绿色荧光蛋白基因转染研究

目的:探索小鼠胚胎神经干细胞(neuralstemcells,NSCs)的体外培养,探讨NSCs作为基因靶细胞,以及增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)标记NSCs的可行性。方法:胚胎小鼠脑组织分离神经干细胞,无血清细胞培养,免疫细胞荧光染色技术鉴定。NucleofectorTM转染仪将增强型绿色荧光蛋白基因转导入NSCs,用G418筛选,在荧光显微镜下观察并挑选EGFP表达最强的克隆,并做免疫荧光鉴定及诱导分化细胞的鉴定。结果:从胚胎小鼠脑组织分离的细胞具有连续克隆能力,表达神经上皮干细胞蛋白,诱导分化后的细胞表达神经细胞和星形胶质细胞特异性的蛋白。增强型绿色荧光蛋白报告基因转染神经干细胞后能高效表达,且不影响其增殖、分化能力。结论:小鼠胚胎神经干细胞能够在体外适宜的条件下进行长期培养;神经干细胞可直接作为基因靶细胞;转染EGFP的神经干细胞表达稳定且对NSCs的增殖和分化无明显影响。

骨髓间充质干细胞诱导分化的成骨细胞转染增强型绿色荧光蛋白基因后复合生物衍生骨的研究

目的:探讨绿色荧光蛋白(GFP)基因转染本身是否可以改变细胞复合材料的生物学特性,从而影响材料生物相容性的正确评价。方法:将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转基因技术成功标记人源骨髓间充质干细胞(MSCs)诱导分化的成骨样细胞,再与人源生物衍生骨复合培养;同时设立未转染EGFP基因的骨髓MSCs诱导分化的成骨样细胞直接与人源生物衍生骨复合培养作为对照,通过倒置显微镜、荧光显微镜、扫描电镜对比观察。结果:发现转染EGFP基因的MSCs诱导分化的成骨样细胞能够成功地复合于人源生物衍生骨上,且生长状态较好。与未转染组细胞复合材料的情况相比,转染组与其没有明显差异。结论:EGFP基因转染技术没有对MSCs诱导分化的成骨样细胞复合衍生骨的能力以及增殖生长活性造成明显损害,从而不会影响对于材料生物相容性的正确评价。

增强型绿色荧光蛋白基因在永生化大鼠神经前体细胞株的表达

目的：研究重组腺相关病毒载体介导的增强型绿色荧光蛋白基因在永生化大鼠神经前体细胞的转染效率及其表达情况．方法：携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组腺相关病毒转染永生化大鼠神经前体细胞，持续观察转基因神经前体细胞绿色荧光蛋白的表达情况，并计算转染效率．应用巢蛋白抗体和抗猿肾病毒40大T抗原抗体进行细胞鉴定，50mL／L胎牛血清诱导细胞分化后，应用神经元和星形胶质细胞特异性标志物抗体检测其分化能力。结果：荧光显微镜观察显示转染后24h神经前体细胞即有绿色荧光蛋白表达，转染后72h，大部分细胞表达绿色荧光蛋白，转染效率可达90％，经传代培养8wk后，表达绿色荧光蛋白的阳性细胞仍可高达70％～75％，免疫细胞化学结果显示转绿色荧光蛋白神经前体细胞巢蛋白和抗猿肾病毒40大T抗原抗体染色均为阳性，50mL／L胎牛血清可诱导其分化为神经元和星形胶质细胞．结论：携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组腺相关病毒可高效转染永生化大鼠神经前体细胞，并可在细胞中长期稳定地表达，绿色荧光蛋白作为良好的示踪剂可应用于神经前体细胞的体内移植．

增强型绿色荧光蛋白基因在鸡胚盘细胞中的表达

从鸡胚发育为 X期的鸡蛋中取胚盘细胞 ,经原代培养后用带增强型绿色荧光蛋白( EGFP)作为标记基因的真核表达质粒 p L EGFP-C1转染鸡胚细胞观察 EGFP基因的表达情况 ,结果在不同条件下的活细胞均见有 EGFP基因的稳定表达。这提示通过 EGFP基因转染鸡胚盘细胞可连续且直接观察活细胞中的表达 。

增强型绿色荧光蛋白基因与人血管内皮生长因子受体KDR基因胞外1-3区域融合表达载体的构建

目的构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与人血管内皮生长因子受体KDR基因胞外1-3区域(KDRn3)的融合基因真核表达载体,为研究KDRn3在抑制视网膜新生血管性疾病中的作用奠定基础。方法以质粒pcDNA3.1/KDRn3为模板,PCR扩增KDRn3基因,将目的片段克隆至pMD18-T载体,其产物双酶切后连接到质粒pEGFP-Nl中。结果酶切及琼脂糖电泳分析表明提取及纯化的重组质粒含有目的基因片段,大小正确。结论成功构建了EGFP与人KDRn3的融合基因真核表达载体pEGFP-N1/KDRn3。

神经干细胞的体外培养及增强型绿色荧光蛋白基因转染研究

目的探索大鼠胚胎神经干细胞(NSCs)的体外培养,探讨NSCs作为基因靶细胞,以及逆转录病毒介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记NSCs的可行性。方法胚胎大鼠脑组织分离神经干细胞,无血清培养,免疫组织化学技术鉴定。用Lipofectin将pLEGFPN1逆转录病毒载体导入PA317包装细胞,用G418筛选获得抗性细胞克隆,扩增抗性细胞并收集病毒上清;病毒上清感染神经干细胞,用G418筛选,荧光显微镜下观察并挑选EGFP表达最强的克隆,并做免疫组化鉴定;进一步培养扩增,做传代细胞的分化鉴定。结果培养出大鼠胚胎神经干细胞。荧光显微镜下检测感染逆转录病毒的神经干细胞,以及免疫组化鉴定,均显示EGFP获得良好表达;而且感染细胞能够被诱导分化为神经元和神经胶质细胞。结论大鼠胚胎神经干细胞能够在体外适宜的条件下进行长期培养;神经干细胞可直接作为基因靶细胞;利用逆转录病毒载体,建立稳定表达EGFP的神经干细胞系具有可行性,为进一步做标记细胞移植研究奠定基础。

重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因经角膜基质瓣转染兔角膜基质细胞的实验研究

目的研究重组腺相关病毒(rAAV)介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因经角膜基质瓣转染兔角膜基质细胞的有效性和安全性。方法微型角膜刀制作兔角膜基质瓣;转染组用含rAAV-EGFP转染液浸泡角膜瓣和角膜基质床10min,对照组用等量BSS液浸泡角膜瓣和角膜基质床10min,不同时间点(1,3,7,14,21d)通过荧光体视镜观察角膜出现EGFP荧光的起始时间及分布情况,收集角膜,其中一半用激光共聚焦显微镜观察、照相,另一半固定后行HE染色。结果转染组于转染第3天,体视荧光显微镜下观察到兔眼角膜瓣内面及基质床中开始有GFP阳性表达;7d达到高峰,21d时仍有微弱表达。第7天在激光共聚焦显微镜下可观察到兔角膜基质中有明显的荧光表达,对照组角膜始终未见荧光表达,转染组和对照组角膜HE染色均未见炎症细胞浸润及新生血管等异常。结论rAAV-EGFP经兔角膜基质瓣转染角膜基质细胞的方法可将基因安全、相对高效地转入角膜基质细胞,为转基因治疗角膜病提供了新的转染途径。