采用GFP标记筛选抑制多血清型口蹄疫病毒3C基因表达的siRNA

为筛选出可抑制多种血清型口蹄疫病毒(FMDV)的小干扰RNA(siRNA),本试验通过多血清型口蹄疫病毒序列比对与siRNA设计分析,筛选出潜在抗多血清型siRNA位点;通过体外合成A型、O型和Asia I型病毒部分基因序列,制备绿色荧光蛋白(GPF)基因融合表达载体;将化学合成的siRNA与融合表达载体共转染,通过GFP观察、Western blot和实时荧光定量反转录PCR(qRT-PCR)方法检验目标siRNA对融合基因的抑制效率。生物信息分析发现,多血清型口蹄疫病毒3C基因高度保守并存在潜在siRNA作用靶位,GFP-3C融合表达载体成功构建,与化学合成的siRNA1-3C共转染293T细胞,GFP观察发现,siRNA1-3C可有效抑制来源于A型、O型和Asia I型3C基因的GFP-3C荧光信号且持续时间达72 h,Western blot检测证实此结果。qRT-PCR检测发现,siRNA1-3C对3个GFP-3C融合基因转录水平抑制效率超85%,且作用可维持72 h。本试验利用GFP作为筛选标记成功筛选出1个作用于FMDV 3C基因的siRNA,为开发多血清型口蹄疫抑制剂提供参考依据。

携带pcDNA3s与EGFPC3质粒的重组减毒沙门氏菌的免疫性与EGFP的表达

目的研究HBsAg DNA重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的免疫性与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因EGFPC3在小鼠体内的表达。方法将质粒pcDNA3s与pEGFPC3分别电转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SL8786,构建重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL8786/EGFPC3与SL8786/pcDNA3s。利用时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)检测小鼠的血清抗体的含量,以及重组菌引起的T细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。用荧光显微镜观察EGFPC3表达。结果口服SL8786/p cDNA3s免疫小鼠后,可诱导产生较强的特异性CTL应答。口服免疫小鼠后第11周抗-HBs含量最高。用流式细胞术检测贴壁培养的2只小鼠的脾细胞中SL8786/EGFPC3阳性率分别为19.20%和17.36%,而SL8786/pcDNA3口服的2只小鼠脾细胞中的EGFP阳性率分别仅为1.95%和1.63%。给小鼠口服SL8786/EGFPC33周后,在小鼠肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、十二指肠及肌肉等组织中,均有EGFPC3的表达。结论口服SL8786/pcDNA3s在小鼠体内诱导了特异性细胞和体液免疫应答。携带EGFPC3的重组鼠伤寒沙门氏菌SL8786/EGFPC3在小鼠的部分组织中产生绿色荧光表达,该重组菌的构建为减毒沙门氏菌作为活载体基因工程疫苗的研制提供了一个优良模型。

携带EGFPC3质粒的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌在小鼠体内的表达

目的构建重组减毒鼠伤寒沙门氏菌X8786/pEGFP-C3,检测增强型绿色荧光蛋白C3(EGFP-C3)在小鼠体内荧光表达。方法将质粒pEGFP-C3电转化到减毒鼠伤寒沙门菌SL8786,构建重组减毒鼠伤寒沙门菌X8786(pEGFP-C3),分别灌胃饲服昆明种小鼠,流式细胞仪检测脾脏细胞荧光表达,利用荧光显微镜检测小鼠组织荧光表达。结果在体外稳定试验中,重组菌经LB固体及液体培养基连续传15代后,单个菌落和菌液均呈绿色;流式细胞仪结果证实,体外情况下,减毒鼠伤寒沙门菌可以将pEGFP-C3转入小鼠腹腔灌洗巨噬细胞,并在其中表达。在体内稳定试验中,经昆明种小鼠连续传代10次,从肝脏、脾脏中分离的细菌经LB固体培养仍为绿色,证明构建的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌是稳定的。用免疫剂量的重组细菌接种昆明种小鼠后,观察1个月未见有异常现象,同时剖检后也未见脏器有眼观病变。免疫一定时间后,在小鼠肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、十二指肠、肌肉等组织有荧光表达。结论表达EGFP-C3的重组鼠伤寒沙门氏菌的成功构建为减毒沙门氏菌作为活载体的基因工程疫苗研制提供一个优良模型。

携带pEGFPC3的减毒鼠伤寒沙门氏菌在雏鸡体内的表达

构建了重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL8786/pEGFP-C3,检测了PEGFP-C3在雏鸡体内荧光表达。将重组减毒鼠伤寒沙门菌SL8786/pEGFP-C3分别灌胃饲服3日龄雏鸡,结果表明,在体外稳定试验中,重组菌经LB固体及液体培养基连续传20代后,单个菌落和菌液均呈淡绿色。流式细胞仪结果证实,减毒鼠伤寒沙门菌可以将pEGFP-C3转入脾脏细胞,并在其中表达。在体内稳定试验中,经雏鸡连续传代12次,从肝脏、脾脏中分离的细菌经LB固体培养仍为绿色,证明构建的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌是稳定的。用免疫剂量的重组细菌接种雏鸡后,观察1个月未见有异常现象,同时剖检后也未见脏器有眼观病变。免疫一定时间后,在雏鸡肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、十二指肠、肌肉等组织有荧光表达。表达PEGFP-C3的重组鼠伤寒沙门氏菌在鸡体产生荧光表达,为减毒沙门氏菌作为活载体的基因工程疫苗研制提供一个优良模型。

Wnt7b重组反转录病毒载体的构建及其在C3H10T1/2中的表达

背景:诱导骨髓基质干细胞成骨条件的优化与探讨是再生医学研究的热点。前期实验发现Wnt7b在骨发育中的作用,此次实验是前期工作的延续。目的:构建Wnt7b重组反转录病毒载体,观察其在C3H10T1/2中的表达。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-01/2008-08在华盛顿大学医学院和同济大学附属第十人民医院中心实验室完成。材料:pXy-Wnt7b购于ATCC公司,载体pCIG-IRES-EGFP,pLef-Luciferase,pCMV-Rennilla,反转录病毒载体pSFG和包装细胞GP293由华盛顿大学医学院提供。方法:用多步亚克隆技术构建目的基因Wnt7b和标记基因加强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)双表达重组反转录病毒载体pSFG-Wnt7b-IRES-EGFP,在条件培养液中经GP293包装,并在常规培养液中释放出假病毒并将其转染C3H10T1/2细胞,检测成骨活性诱导中的作用和荧光素酶报告基因检测信号转导通路。主要观察指标:①Wnt7b重组反转录病毒转染C3H10T1/2细胞的表达。②Wnt7b诱导C3H10T1/2碱性磷酸酶生成分析。③Wnt7b信号转导分析。结果:构建目的基因的Wnt7b和标记基因EGFP双表达重组反转录病毒载体能够高效地表达,转染C3H10T1/2细胞后能诱导碱性磷酸酶的生成。Wnt7b信号转导分析可见Wnt7b成骨作用通过Noncanonical途径。结论:Wnt7b在C3H10T1/2中能高效表达,能显著诱导骨发育的重要标志--碱性磷酸酶的生成,Noncanonical途径在其中起重要作用。

外酶C3转移酶转基因表达对小梁细胞的影响

目的:探讨腺病毒载体介导的外酶C3转移酶(exoenzyme C3 transferase,C3)表达对体外培养的正常或地塞米松处理的人类小梁细胞的作用.方法:构建C3和绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒表达载体(AdC3GFP).用AdC3GFP转导人类正常或经地塞米松处理的小梁细胞.观察(1)小梁细胞肌动蛋白、粘着斑蛋白(vinculin)、β-链蛋白(β-catenin)的变化;(2)地塞米松能否诱导小梁细胞形成肌动蛋白交联网(cross linked actin networks,CLANs)结构以及AdC3GFP对CLANs的影响.以仅表达GFP的腺病毒载体(AdGFP)作为对照.结果:与对照相比,AdC3GFP转导小梁细胞后3～4d细胞出现肌动蛋白细胞骨架裂解,相应粘着斑蛋白阳性的粘着斑减少和β-链蛋白染色丧失.与非转导细胞相比,AdGFP转导细胞肌动蛋白细胞骨架,粘着斑蛋白和β-链蛋白染色均与非转导细胞类似.经地塞米松处理的小梁细胞形成典型CLANs结构,AdC3GFP可降解肌动蛋白及已形成的CLANs结构.结论:C3基因表达产物可降解小梁细胞肌动蛋白和细胞连接以及由地塞米松诱导的小梁细胞CLANs形成.提示C3基因治疗可能是青光眼降眼压治疗的有效方法.

口蹄疫病毒3C基因与增强型绿色荧光蛋白基因的真核共表达

为验证siRNAs对口蹄疫病毒(FMDV)复制的抑制效果,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增Asia 1型口蹄疫病毒Jiangsu/China/2005株的3C基因,克隆入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pEGFP-N1中,并进行双酶切、PCR及测序鉴定。将阳性重组质粒转染PK-15细胞,检测EGFP的表达和3C基因转录水平。结果显示,经PCR及双酶切鉴定,目的基因片段大小与预期相符,测序结果与Jiangsu/China/2005株相应序列一致。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内有EGFP表达,实时荧光定量PCR检测到细胞内有3C基因的转录。证实,成功构建了FMDV 3C基因与EGFP共表达质粒并在PK-15细胞中获得了表达。

绿色荧光蛋白在绿色裸小鼠脑组织中的表达

自1997年Okabe等研究出增强型绿色荧光蛋白（EGFP）转基因小鼠，EGFP荧光示踪在干细胞研究中便发挥着重要作用。我们将这种绿色小鼠与NC裸小鼠杂交，建立了表达EGFP的裸小鼠C57BL／6J—EGFPXNC／Nud，本文着重对小鼠脑组织中EGFP表达进行分析鉴定。

hTERT启动子调控的腺病毒载体的构建及在前列腺癌细胞中的表达

目的 构建人端粒酶逆转录酶 (hTERT )启动子调控的表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的腺病毒系统 ,并研究其在前列腺癌细胞株PC 3中的表达。方法 构建带有hTERT启动子的腺病毒穿梭载体pDC3 15 Tp EGFP ,细胞重组技术获得腺病毒AdhTERT EGFP ,体外转染PC 3及人胚肺成纤维细胞株MRC 5 ,通过RT PCR和倒置荧光显微镜分别在mRNA和蛋白质水平检测EGFP的表达。带有小鼠巨细胞病毒 (mCMV)启动子的腺病毒Ad EGFP作为阳性对照。结果 成功构建出腺病毒AdhTERT EGFP ,滴度为 4.2× 10 9空斑形成单位 (pfu) /ml,分别转染PC 3和MRC 5 ,前者表达EGFP的阳性细胞数为 (66.4% 3 .3 ) % ,而后者不表达EGFP(P <0 .0 1) ;对照病毒Ad EGFP在PC 3和MRC 5中分别有 (88.1± 2 .2 ) %及 (89.2± 3 .1) %的细胞表达EGFP ,两者表达量差异无统计学意义。结论 该腺病毒系统中hTERT启动子调控下游基因可选择性地在前列腺肿瘤细胞中表达 ,在正常细胞中不表达 ,具有明显的靶向性。