PIG-A基因逆转录病毒表达载体及包装细胞系的建立

目的构建含磷脂酰肌醇聚糖A类基因（PIG-A）的逆转录病毒载体并对其进行包装，获得稳定的产毒细胞系。方法采用PCR方法从质粒pEBPIG-A中扩增PIG-A基因片断，BarnHI及XhoI双酶切后连接至逆转录病毒载体pLEGFP-C1，用限制性内切酶和DNA序列测定的方法对重组质粒进行鉴定。脂质体法转染PA317包装细胞，荧光显微镜下观察EGFP瞬时表达，G418筛选抗性克隆，收集病毒上清后感染NIH3T3细胞测定病毒滴度。结果酶切证实PIG-A基因克隆至逆转录病毒载体，测序结果和原始序列相同。重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞，24～48h后荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达。经CAl8筛选得到6个稳定抗性克隆，病毒滴度最高达1．6×10^5CFU／ml。结论构建了含PIG-A基因的逆转录病毒载体，获得了稳定的产毒细胞系。