原核增强子样序列研究进展

增强子是真核细胞中增强启动子功能的顺式作用元件。随着人们对原核生物基因表达调控的深入研究 ,人们发现在原核生物的调控系统和某些病毒基因组DNA片段中也具有增强子样功能。这些研究对揭示原核系统的基因表达调控和增强外源基因在原核系统中的表达水平具有重要的理论意义和实用价值。

痘苗病毒增强子样序列的特性研究

利用带有氯霉素乙酰转移酶报道基因的检测载体，从痘苗病毒基因组 Ｄ Ｎ Ａ 中筛选到一个增强子样片段。序列分析表明，该片段长２８３ｂｐ ，是痘苗病毒 Ｄ Ｎ Ａ 依赖性 Ｒ Ｎ Ａ 聚合酶的一部分，具有两段２４ｂｐ 长的重复序列。采用带有β－ 半乳糖甘酶报道基因的载体检测发现，该片段正向可以使报道基因表达增强１０９ 倍，反向可以增强３８ 倍。 Ｒ Ｎ Ａ ｄｏｔ ｂｌｏｔ 实验证实，它对基因的增强活性表现在转录水平上。

大肠杆菌原核增强子样序列的克隆及其结构与功能的研究

利用氯霉素乙酰转移酶(cat)以及β半乳糖苷酶(lacZ)基因作为报告基因,从大肠杆菌MC1061株染色体基因组中克隆到3个原核增强子样序列———MC2,MC8,MC9,这3个片段均具有正反向增强活性,对β半乳糖苷酶基因的增强活性(正向)在2～55倍之间。采用体内转录,RNADotblot杂交的方法对MC8的功能进行了研究,结果表明,MC8片段对于基因表达的调控发生在转录水平上。用核酸外切酶III末端缺失的方法对MC8的功能区进行了定位。结果显示,MC8的功能区位于距其正向克隆5′端450～950bp长约500bp的区段内。在450～600bp以及840～950bp区段内至少分别含有一个功能位点。序列分析的结果表明,MC8功能区有3个AT丰富区,其中2个分别位于450～600bp以及840～950bp区段内。

原核增强子样序列3A的克隆及其结构与功能的研究

从大肠杆菌 C60 0株染色体基因组中筛选到一个原核增强子样序列 3A,其正、反向增强活性分别能提高 β-半乳糖苷酶活性 7.1 1和 2 .93倍 .采用体内转录 ,RNA斑点印迹杂交的方法 ,证明3A序列对于基因表达的调控发生在转录水平上 . 3A功能区的研究表明 ,3A增强活性主要位于距其正向克隆 5′端 (增强活性较强的方向称为正向 ,反之为反向 ) 30 0～ 540 bp,长约 2 4 0 bp的区段内 ,并证明

痘苗病毒原核增强子样序列VV1的结构和功能的研究

增强子是基因转录调控的一个重要而必需的元件,其最.初发现于SV40早期基因的表达过程中[1,2].自此以后,相继发现这一远端基因调控序列广泛存在于真核细胞、原核细胞和病毒基因组中[3-7].本文选取活性较高的痘苗病毒原核增强子样序列VV1为目的片段,利用缺失和随机突变的方法对VV1功能区进行分析,阐明其结构和功能的关系,进一步丰富原核增强子的作用机理和基因转录调控方面的研究.

大肠杆菌C600染色体DNA中原核增强子样序列的克隆和鉴定

采用大肠杆菌trp启动子,氯霉素乙酰转移酶(CAT)作为标记基因,构建了两个应用氯霉素压力筛选增强子序列的检测载体pKT和pKTP。用pKT,pKTP及pKN2从大肠杆菌C600染色体基因组中克隆到3个原核增强子样序列3A,8A和V6S,这3个片段均具有正、反向增强活性,对β-半乳糖苷酶表达的正向增强活性达到7～8倍,反向增强活性2～3倍。RNA斑点杂交实验证明,3A,8A和V6S片段对于基因表达调控的增强作用均发生在转录水平上。

痘苗病毒VV16原核增强子样序列的克隆及其结构与功能的研究

利用带有氯霉素乙酰转移酶报道基因的检测载体 ,从痘苗病毒基因组DNA中筛选到一个增强子样片段VV16。序列分析表明 ,该片段长 112bp ,是痘苗病毒DNA依赖性RNA聚合酶、polyA聚合酶亚单位和DNA聚合酶基因RPO30的一部分 ,含有 4个AT丰富区。采用带有β 半乳糖苷酶报道基因的载体检测发现 ,该片段正向可以增强报道基因表达 9 0倍 ,反向可以增强报道基因表达 4 1倍。RNADotblotting实验证实 ,它对基因的增强活性表现在转录水平上。DNA删切实验证实 ,5′端 10bp及 3′端 12bp对其活性有重要调节作用 ,而该片段nt76～ 82的序列对增强子的活性至关重要。

痘苗病毒增强子样序列的筛选及应用研究

目的从痘苗病毒基因组中筛选原核增强子样序列,构建携带原核增强子样序列的表达载体,探讨其对干扰素基因表达的影响。方法采用氯霉素乙酰转移酶基因(cat)作为报告基因,从痘苗病毒基因组中筛选具有原核增强子样活性的序列,构建携带增强子样序列VV1的表达载体,表达干扰素基因和检测干扰素活性。结果从痘苗病毒天坛株DNA基因组中筛选出18个在大肠埃希菌中具有增强活性的序列,从中筛选到两个原核增强子样序列VV1和VV16,VV1正反向分别可使lacZ基因活性提高10.9倍和3.8倍,VV16正反向分别可使lacZ基因活性提高9.0倍和4.1倍;证实它们的增强活性体现在转录水平;用痘苗病毒增强子样序列VV1构建的表达载体,其表达的IFN-α2b型干扰素比原表达载体活性高2.6倍。结论从痘苗病毒天坛株DNA基因组中筛选到2个原核增强子样序列-携带有痘苗病毒增强子样序列的表达载体可提高干扰素基因的表达水平。

原核增强子样序列的筛选及其应用研究

目的 从大肠埃希菌C600株染色体基因组中筛选原核增强子样序列,构建携带原核增强子样序列的表达载体,探讨其对干扰素基因表达的影响.方法 采用氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）作为报告基因,从大肠埃希菌C600株染色体基因组中筛选具有原核增强子样活性的序列,构建携带增强子样序列的表达载体,表达干扰素基因和检测干扰素活性.结果 从大肠埃希菌C600株染色体基因组中筛选到一个原核增强子样序列3A,其正、反向增强活性分别能提高β-半乳糖苷酶活性7.11和2.93倍.证实它的增强活性体现在转录水平;用原核增强子样序列3A的功能区3P3构建的表达载体,其表达的IFN-α2b型干扰素比原表达载体活性高3.7倍.结论 从大肠埃希菌C600株染色体基因组中筛选到一个原核增强子样序列3A,携带有原核增强子样序列的表达载体可提高干扰素基因的表达水平.

原核增强子样序列筛选及其功能区域鉴定

目的从污水和土壤中富集的微生物菌体中筛选原核增强子样序列,构建包含增强子样序列的表达载体,并通过构建缺失突变体鉴定其功能区域。方法将人乳头瘤病毒（human papilloma virus,HPV）主要衣壳蛋白基因L1截短序列L11与氯霉素乙酰转移酶基因（chloramphenicol acetyltransferase,CAT）连接,作为报告基因,从污水和土壤富集的微生物菌体中筛选具有增强子活性的序列,构建包含增强子样序列的表达载体,表达HPV L11蛋白,检测其增强活性;通过构建ER1的缺失突变体,测定不同突变体对L11蛋白表达的作用情况,确定其功能区域。结果从样品基因组DNA中筛选出1条具有一定增强蛋白表达功能的增强子样序列,可使检测菌株氯霉素抗性提高5倍,HPV L11蛋白表达水平提高1.78倍。其增强活性主要位于117~317 bp区域。结论从污水和土壤中成功筛选到1条增强子样序列,携带有增强子样序列的表达载体可提高目的蛋白表达水平。

大肠杆菌M增强子样序列结构和功能的研究

构建了以β-半乳精苷酶基因为报告基因,适用于原核增强序列研究的pAC载体.应用该载体进行的转录增强实验证明,一段已克隆的具有增强基因表达功能的大肠杆菌染色体M序列,对被调控基因的增强作用是发生在转录水平,其能使β-半乳糖苦酶基因特异性的mRNA转录增加6.5倍,与应用该载体测得的表达增强活性一致.通过构建一系列正、反向M序列缺失突变体并对其进行的研究表明,在靠近M序列5’端的340bp区域内存在3个相互作用、与增强活性密切相关的部位,分别位于M序列3’端上游770,610和470bp处.应用PCR技术对大肠杆菌染色体对应于M序列5’端上游207bp进行了克隆,研究显示M序列具有功能上的完整性.

在大肠杆菌中提高人α1b型基因工程干扰素的表达

将人α１ｂ型干扰素（ＩＦＮα１ｂ）基因插入带有原核增强子样序列的新型载体ｐＢＶ３２２，使干扰素在大肠杆菌中的表达水平明显高于原表达载体，达到１６×１０８ｕ／Ｌ培养液。重组质粒的特点是：含增强子序列Ｘ，ｔｒｐ启动子控制。利用ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅ、ＣＭＳｅｐｈａｒｏｓｅ离子交换层析及单克隆抗体亲和层析纯化ＩＦＮα１ｂ，获得了电泳纯产品，其比活性为２×１０７ｕ／ｍｇ，分子量为１９ｋＤａ。此外，用ｐＡＴ１５３代替ｐＢＶ３２２，构建了带有和不带有Ｘ序列的两种表达载体。

具有增强蛋白质表达活性序列ER3的筛选及其功能区域的初步鉴定

目的：利用构建的增强子样序列筛选载体,筛选在大肠杆菌中增强外源蛋白质表达的序列,并利用删除突变体初步鉴定其功能区域.方法：以氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因序列与人乳头瘤病毒（HPV）主要衣壳蛋白基因 L1 的截短序列L11连接作为报告基因,从采集的样品中筛选增强子样序列,通过蛋白质表达来检测其增强活性,并通过构建删除突变体来初步鉴定其功能区域.结果： 成功筛选到一条增强子样序列,可使检测载体氯霉素抗体提高11倍,融合蛋白表达水平提高2.26倍,其功能区域主要集中在1~265bp.结论：从收集的样品中成功筛选出一个增强子序列,能提高外源基因在大肠杆菌中的表达.