基于毛细管电泳的环介导恒温扩增技术检测方法研究

以大肠杆菌（E.coli）为对象,采用环介导恒温扩增技术（LAMP）对其扩增,在实验室自制的毛细管电泳-诱导荧光平台上建立了LAMP产物的检测新方法。引物F3,B3,FIP,BIP扩增的E.coli LAMP产物大小为240 bp。优化的毛细管电泳条件为：毛细管有效长度/总长度（10 cm/15 cm）,筛分介质溶液为0.5%羟乙基纤维素（1 300 K）,电场强度（100 V/cm）,进样条件（100 V/cm,1.0 s）。毛细管电泳时,DNA长度在100~500 bp范围内与其迁移时间呈线性关系,相关系数为0.996。在相同毛细管电泳条件下对E.coli LAMP产物进行分析,并利用这种线性关系在电泳图中对E.coli LAMP产物与假阳性产物做区分,结果表明,毛细管电泳技术不仅可在15 min内实现LAMP产物及附加产物的快速检测,而且可快速区分LAMP阳性及假阳性实验产物。采用建立的毛细管电泳快速检测LAMP产物的方法,对AB0174 E.coli基因实施了LAMP,结果表明该方法适合DNA LAMP产物的快速检测。

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立

以灭活的亚洲Ⅰ型口蹄疫细胞培养病毒为材料,通过在病毒基因组的3D区域设计3对引物,建立口蹄疫病毒的RT-LAMP检测方法,对反应体系中的MgSO4、Betaine、Bst DNA PoLymerase、dNTP、ThermoScriptTM Rnase H-Reverse Transcriptase、3对引物等成分以及反应条件(反应温度)分别进行优化,并进行敏感性和特异性确定。建立了亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒的RT-LAMP检测方法,可以采用琼脂糖凝胶电泳、颜色变化、生成的沉淀等现象或者直接采用荧光PCR仪判定反应结果,为口蹄疫的现场快速检测提供了一种更加简便快速的方法,可以满足现场检疫的需要。

二胺与二酮环聚合反应的不同途径与产物

在质子性溶剂中,3,5-二叔丁基-1,2-苯醌分别与双[(三异丙基硅烷基)乙炔基]萘-2,3-二胺和双[(三异丙基硅烷基)乙炔基]蒽-2,3-二胺反应,在不同条件下得到含有吡嗪环的缩合产物1和含有咪唑环的缩合产物2.通过核磁共振波谱、紫外-可见光谱、高分辨质谱及单晶X射线衍射表征确定了产物的结构,并提出了可能的反应机理.

多重分子信标环介导等温扩增快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

目的建立多重分子信标环介导的等温扩增快速检测葡萄球菌耐药基因mecA和种特异性基因femA的方法。方法利用包被有SPA单克隆抗体的磁珠富集样品中的金黄色葡萄球菌,快速提取其DNA,用多重环介导等温扩增反应(LAMP)同时扩增金黄色葡萄球菌耐药基因mecA和femA,扩增条件为65℃保温1 h;在反应过程中,两种分子信标荧光探针分别与mecA和femA基因的扩增产物互补序列结合,探针上的FAM和TET荧光分子产生两种荧光,最后检测反应管中的两种荧光值。结果该方法的最低检测限为10CFU/ml,与M-H培养基苯唑西林药敏试验结果相比较,灵敏度99.0%,特异度90.9%。结论该方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便快速,适用于直接快速基因检测临床样品中MRSA。

环介导等温扩增反应的原理及应用

环介导等温扩增反应(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是日本学者Notomi于2000年在NucleicAcids Res杂志上公开的一种新的基因诊断技术,该法操作简便,扩增效率及灵敏度高,已广泛应用于食品、临床、农业等领域,有望成为主流的基因诊断方法。本文对LAMP的反应特征及原理、优缺点、临床应用作一综述。

非洲猪瘟病毒环介导等温扩增诊断方法的建立

通过对GenBank中登录的非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白基因序列进行分析,根据p72保守区序列设计合成了内(FIP,BIP)、外(F3,B3)2对引物,其中外引物扩增片段的大小为184bp。通过对反应条件进行优化,建立了非洲猪瘟LAMP检测方法。结果显示,该方法在62℃保温60min即可完成,最低可检测到1×101 copies/μL的病毒DNA,与常规PCR方法相比灵敏度高100倍。对ASFV、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒基因组DNA同时检测,结果仅有ASFV出现条带,而其他均未出现目的条带。表明,建立的ASFV-LAMP诊断方法具有较好的特异性和敏感性。

犬瘟热病毒反转录环介导等温扩增诊断方法的建立

根据GenBank中犬瘟热病毒H基因保守序列设计合成了内(FIP,BIP)、外(F3,B3)2对引物,其中外引物扩增片段的大小为247 bp。通过对反应条件中内、外引物的比例、dNTP浓度、Mg2+浓度、反应温度和时间等条件逐一优化,成功建立了犬瘟热病毒的RT-LAMP检测方法。该方法在60℃下保温50 min即可完成,可检测至10-1TCID50的病毒,与常规RT-PCR检测方法相比灵敏度高100倍。对犬腺病毒、犬细小病毒、狂犬病病毒、犬冠状病毒、犬瘟热病毒同时检测,结果显示,本方法具有高度的特异性。

环介导等温扩增检测恶性疟原虫的应用研究

目的探讨环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测恶性疟患者血中疟原虫的敏感性和特异性。方法收集恶性疟患者和健康人血液样品,分别用LAMP、镜检法和巢式PCR检测恶性疟原虫,计算LAMP的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值,并与巢式PCR进行比较。结果共检测78份恶性疟患者和30份健康人血样,其中72份患者血样LAMP检测为阳性,以镜检法为金标准,LAMP筛检的灵敏度为92.3%,特异度为100%,阳性预测值和阴性预测值分别为100%和83.3%;以巢式PCR为参考,LAMP筛检的灵敏度为97.2%,特异度为94.4%。结论 LAMP方法检测恶性疟原虫的敏感度和特异度与巢式PCR方法相近,可应用于现场恶性疟检测。

动物布鲁氏菌病快速诊断方法研究进展

布鲁氏菌病是一种流行范围广、危害严重的人畜共患传染病。近年来,布鲁氏菌病的人畜疫情在国内外均出现回升势头,严重影响了流行地区的养殖产业发展,并引发严重的公共卫生问题。因此,该病的快速准确检测能为预防、治疗提供早期、有效的疫病信息。鉴于布鲁氏菌病危害的严重性,建立快速有效的检测方法是十分必要的,是布鲁氏菌病早期诊断和疾病控制的关键。本文将对多重PCR、实时定量荧光PCR、LAMP等分子生物学检测方法以及ELISA、胶体金试纸条等免疫学检测方法两个方面对布鲁氏菌病快速检测方法的研究进展进行综述。其中LAMP方法和胶体金免疫层析法对布病的检测更加适合在基层的推广和使用,并且免疫层析技术正朝着定量、高灵敏度、多标记检测等方向发展。

同时检测贝类派琴虫和包纳米虫的双重LAMP方法的建立

为满足贝类寄生虫快速检测需求,本研究根据GenBank中发布的派琴虫ITS序列和包纳米虫18SrRNA序列的保守区域分别设计LAMP扩增引物,分别建立了两种寄生虫的单重LAMP检测方法,进一步对反应体系进行优化,组装成两种寄生虫的双重LAMP方法,同时还进行了特异性检测和敏感性检测,并通过对扩增产物进行限制性内切酶酶切检验双重LAMP方法的准确性。结果表明本研究建立的贝类寄生虫双重LAMP方法具有较好的特异性,检测派琴虫时的最低检测限为10拷贝/μL质粒DNA,检测包纳米虫时的最低检测限为100拷贝/μL质粒DNA,同时酶切试验也验证了双重LAMP检测结果的准确性。对随机采自东海和黄海的20份菲律宾蛤仔和10份美国进口牡蛎的检测结果显示,该双重LAMP方法在口岸检疫工作中可以作为派琴虫和包纳米虫的快速检测方法。

马铃薯PLRV的RT-LAMP检测方法的构建

为了建立高效、便捷且成本较低的检测方法以应用于马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus,PLRV)检疫防控工作,本研究构建了PLRV的逆转录环介导恒温扩增反应(Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测方法。结果表明:本研究构建的马铃薯PLRV的RT-LAMP检测方法,最低检测下限为10 copies/mL,与PVX、PVM、PVV、PVS、CMV等其他马铃薯病毒无交叉反应,具有良好的特异性,为马铃薯病毒检测技术应用奠定一定基础。

禽流感病毒LAMP快速诊断方法的建立

参考禽流感病毒(AIV)基质蛋白(M)基因设计了两对引物,特异性识别其6个不同位点,建立了基于颜色判定的环介导等温扩增反应(LAMP)方法。试验对不同禽源病毒进行了测试,结果发现该方法仅特异性地检出禽流感病毒(H9和H5亚型)核酸,对AIV病毒的检测极限为10 EID50。人工感染病料检测结果与鸡胚病毒分离法的符合率为96.7%。数据表明,建立的LAMP方法特异、敏感、简便,在禽流感的诊断中具有很大的临床应用潜力。

食源性致病菌核酸检测技术研究进展

近年来,食源性疾病的发病率逐年升高,已成为全球范围内的重大公共卫生问题。致病菌广泛存在于各种食品中,快速检测食源性致病菌,对提供安全的食物和预防食源性疾病具有重要的现实意义。由于传统食源性致病菌检测方法耗时耗力,因此建立食源性致病菌的快速检测技术尤为重要。食源性致病菌的核酸检测技术具有简便、耗时短、特异性强、灵敏度高等优点,已被广泛应用于食源性致病菌的检测。着重介绍近年来用于食源性致病菌检测的核酸检测技术,包括常规聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、多重聚合酶链式反应(multiplex-PCR,mPCR)、实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR,qPCR)、环介导等温扩增反应(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、聚合酶螺旋反应(polymerase spiral reaction,PSR)、重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA),并对其优缺点,以及适用范围进行总结,旨在为开发出简单、快速、有效、准确的检测方法提供一定的理论依据。

Daphnezomines A和B的四环核心骨架合成

在虎皮楠生物碱家族中, daphnezomine A型生物碱仅包含三位成员:daphnezomine A (1), daphnezomine B (2)以及dapholdhamineB.这些生物碱含有独特的氮杂金刚烷骨架,9个连续的手性立体中心,因此呈现出巨大的合成挑战性.报道了分子1和2的四环核心骨架的合成.关键步骤包括一个黄氏酰胺活化增环反应和一个Hutchins-Kabalka还原重排反应.

一种快速检测桉树焦枯病菌(Cylindrocladium scoparium)的LAMP体系的建立及应用

【目的】建立桉树焦枯病快速有效的环介导等温扩增反应LAMP检测技术。【方法】以桉树焦枯病原菌Cylindrocladium scoparium为研究对象,利用Primer Explorer V4.0设计软件,针对C.scoparium的Beta-tubulin gene特异保守区域设计了一套LAMP特异性引物组(内引物FIP/BIP,外引物F3/B3,环引物Loo PF/Loo PB),优化并建立了桉树焦枯病原菌的LAMP快速检测体系。【结果】LAMP反应体系为(50μL):Bst DNA polymerase(8 U)1μL;甜菜碱溶液(5 mol/L)3.0μL;d NTPs(2.5 mmol/L)3.5μL;10×ThermopolⅡ2.5μL;Mg Cl2(100 mmol/L)2μL;FIP/BIP(40μmol/L)各1μL;F3/B3(10μmol/L)各0.5μL;Loo PF/Loo PB(10μmol/L)各1μL;DNA模板2μL;用dd H2O补足体积至50μL。反应程序为:65°C水浴锅中反应45 min,90°C灭活5 min结束反应。特异性检测结果显示,供试的12个样本菌株LAMP产物可以采用肉眼观察、紫外灯照射、添加荧光染料SYBR Green I以及电泳检测条带4种不同的形式予以区分。DNA灵敏度检测结果显示,建立的LAMP体系检测灵敏度可达到40μg/L,完全符合田间检测的要求。野外田间时效检测结果显示,无论是利用紫外检测还是电泳检测均可成功地检测出各地区不同生理小种的桉树焦枯病原菌C.scoparium,且检测效果明显。【结论】该LAMP检测是一项能够作为野外基层田间检测的重要技术。

禽流感病毒的核酸分

禽流感是一种能感染人和动物的烈性传染病,已引起巨大的经济损失,所以对禽流感的诊断防治成为当今研究的一大课题。准确、快速地诊断禽流感是防治的重要前提,EJ益发展的分子生物学技术在诊断方面无疑具有更大优势,文章就禽流感核酸分子诊断方法研究进展进行综述,对禽流感防控提供参考。